奥奈达希瓦氏菌吸收废水中铁离子的作用机制研究

（绍兴市柯桥区环境保护监测站，浙江 绍兴 312030）

1 引言

铁载体是微生物和部分植物分泌到胞外进行结合并获取铁的小分子，其能与高亲和力铁结合。依据其与铁结合的基团的化学性质，铁载体主要分为氧肟酸盐类、儿茶酚类以及羧酸盐类三类。

随着新的铁载体结构被不断解析出来，人们发现有些铁载体包含两种以上螯合铁的基团，属于“混合型”的铁载体。氧肟酸盐类铁载体是自然界中最常见的，氧肟酸基团中的两个氧原子与铁原子形成二齿配体，因此每个此类铁载体都能与Fe3+形成八面体的六齿配体。氧肟酸盐类铁载体与Fe3+的结合常数在1 022～1 032M-1之间，这种强结合能力保证其与铁的复合物不会轻易被水解。奥奈达希瓦氏菌属于革兰氏阴性γ-变形菌门，其可在海水、淡水或一些沉积物中发现，是一种兼性厌氧菌，拥有超过40 多种细胞色素c，这使得其本身的颜色呈现特征性粉红色，并且使其能够呼吸多种电子受体，包括氧气、甘氨酸、硝酸盐、亚硝酸、盐、硫、延胡索酸盐、二甲基亚砜。这些特征使奥奈达希瓦氏菌在生物环境修复和燃料电池等方向备受青睐，是一种重要的环境模式生物。

本文主要研究了ΔputA 在液体LB 中的菌体，颜色为白色，并且其对铁螯合剂2，2´-联吡啶比MR-1 更为敏感，这说明PutA 是铁吸收的一个关键蛋白。而通过测量胞内heme 发现，ΔputA-WC 菌株中heme 含量比MR-1 中低，即ΔputA 的白色表型是由其胞内heme 缺乏引起的。

2 实验材料和方法

所用试剂除非特别说明外，均购于sigma（shanghai，China）公司。基因水平方面的操作，E.coli 和S.oneidensis在有氧条件下培养时，采用Lysogeny Broth（LB，Difco，MI，USA）液体培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L），或者添加了1.5%（W/V）琼脂的LB 固体培养基。液体LB 如无特殊说明均为过滤灭菌，经孔径为0.22 μm的滤膜过滤。培养温度分别为37 ℃和30 ℃。根据实验需求，培养基中添加的化学物质和浓度为2，6-二氨基庚二酸（DAP）0.3 mM，氨苄青霉素50 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，庆大霉素50 μg/mL。

3 实验步骤

3.1 heme stain 染色

heme stain 用于细菌胞内细胞色素c 的染色，具体流程：取2 mL OD600=1.0 的菌液，用PBS 缓冲液冲洗2 遍，随后以12 000 r/min 转速离心1 min。接着用500 μL PBS 溶液重悬后，取40 μL 样品进行SDS-PAGE 电泳实验。此电泳要在4 ℃下进行，并且需要遮光。电泳结束后，使用TMBZ 染液进行染色1.5 h（染色过程也要避光）后，加双氧水（终浓度30 mM）进行显色。TMBZ 染液由两部分溶液混合而成，0.2%TMBZ 溶液（溶剂是甲醇）和0.25 mol/L 乙酸钠。两种溶液在染色前混合即可，不可提前太久。

3.2 胞内heme 含量的测定

测量S.oneidensis 胞内heme 含量时，采用文献[3]的方法进行。此方法原理是，heme 含有铁元素，当加入大量还原剂后，其中的铁会还原成二价铁，还原态heme 与吡啶可以形成吸光系数很高的复合物，通过测定特定波长的吸光度可以检测heme 的含量。此方法共使用了三种溶液，溶液I包含40%（V/V）吡啶、0.2 M NaOH 和500 μM 铁氰化钾K3[Fe（CN）6]。吡啶用来结合还原态heme，NaOH 可以给连二亚硫酸钠提供碱性环境，铁氰化钾能先将所有heme 变成氧化态。溶液II 是0.1 M 铁氰化钾，而溶液III 是0.5 M连二亚硫酸钠（溶剂：0.5 M NaOH）。样品中heme 的含量可通过还原态heme 与吡啶的复合物的吸光度来确定。

3.3 胞内总铁含量测定

本研究测量胞内总铁采用的是菲洛嗪（Ferrozine）显色法。菲洛嗪能与二价铁离子结合成一种复合物，该复合物在550 nm 波长处有吸收峰。由于菲洛嗪不与三价铁离子结合，所以需要用抗坏血酸将样品中所有铁还原成二价。铁被吸收至细菌胞内后，会被储铁蛋白结合成复合物，在测量之前，需要用铁释放剂（iron-releasing regent）将铁游离出来。铁释放剂配方：新鲜配制的1.4 M 盐酸和4.5%（W/V）KMnO4等体积混合。之后再用铁检测试剂（iron-detection reagent）进行测量。铁检测试剂配方：6.5 mM 菲洛嗪、6.5 mM 新亚铜试剂（neocuproine）、2.5 M 醋酸铵、1 M 抗坏血酸。菌样离心收集后，用预冷的PBS 洗2 遍，再用50 mM NaOH 悬浮后超声破碎。100 μL 细胞裂解液与100 μL 10 mM 盐酸混合后，加入100 μL 铁释放剂，60 ℃恒温置于通风橱中2 h。冷却至室温后，加入30 μL 铁检测试剂，30 min 后取出280 μL加入96 孔板中，测量其在550 nm 波长下的吸光度。

4 实验结果分析

由于PutA 与S.oneidensis 铁载体吸收的密切关系，猜想ΔputA 在缺铁的环境中不能有效转运铁，因此其生长会受到影响。所以在LB 中添加不同浓度的铁螯合剂2，2´-联吡啶来观察ΔputA 的生长情况。结果如图1 所示，在LB 中不存在联吡啶情况下，ΔputA 的生长和MR-1 相差很小。这是由于LB 中铁元素和其他营养成分含量丰富，细菌不需要分泌铁载体就已经能够获得维持自身生长所需铁原子。而在LB 中添加50 μM 的2，2´-联吡啶，ΔputA 就已经表现出了明显的生长缺陷，而此时野生型生长基本不受影响。当LB中的2，2´-联吡啶达到150 μM 时，ΔputA 已完全不能生长。此实验说明，在缺铁环境中，PutA 的功能对S.oneidensis 的生长是十分重要的。

图1 实验结果

当S.oneidensis 处于铁匮乏的环境中时，其对铁的需求主要依靠分泌铁载体进行螯合铁，再将铁-铁载体吸收至胞内消化。PutA 作为S.oneidensis 分泌的铁载体、putrebactin的受体，当LB 中添加铁螯合剂2，2´-联吡啶使之缺铁时，ΔputA 不能将胞外的铁-铁载体转运至胞内，使其生长出现缺陷。

5 结语

PutA 作为S.oneidensis 合成的铁载体、putrebactin 的受体，其敲除突变株在LB 中呈现白色性状。在LB 中添加2，2´-联吡啶使其铁处于缺乏状态时，ΔputA 相比于野生型表现出了明显的生长缺陷。这是由于S.oneidensis 吸收环境中的三价铁主要靠分泌出的铁载体，后者螯合铁被PutA 吸收进胞内。putA 基因的破坏会导致S.oneidensis 吸收铁的途径受到破坏，从而使ΔputA 在LB 中生长时难以获取足量的铁而呈现白色菌体表型。因此，奥奈达希瓦氏菌在生物环境修复中应用前景非常广泛。