解毒通络益肾浓缩丸提取工艺的优化

关安琦，高英鑫，王 琳，高 寒，邱智东，徐 伟

（长春中医药大学药学院，长春 130117）

解毒通络益肾方是长春中医药大学附属医院全国名中医南征教授临床实践50 余载的经验方，在治疗糖尿病肾病方面有较好的疗效[1-2]。为便于患者使用，我们将此方开发制成浓缩丸。本文对解毒通络益肾浓缩丸的提取工艺进行优化。

解毒通络益肾浓缩丸中有榛子花、大黄、土茯苓等十味中药材，临床使用方式为煎煮法，故提取方法采用水煎煮。在实验中利用LC-MS/MS 对水煎液进行分析，发现其中大黄酸、大黄素含量较高，且有研究表明，大黄酸[3]、大黄素[4]在治疗糖尿病肾病方面具有较好的活性，故以大黄酸、大黄素的含量作为优化工艺的考察指标。目前工艺优选中多采用正交试验法，但由于它不能在给出的区域上得到回归方程，即不能明确因素与响应值之间的函数关系，进而不能得到整个区域上因素的最佳水平和响应值的最优值。响应面曲线法能满足上述的要求，可提高数学模型的预测性，更好的体现各因素、各指标与效应值的关系[5-7]。因此，本实验选择响应面曲线法优化解毒通络益肾浓缩丸的水提工艺。

1 仪器与试药

LC2030 系列高效液相色谱仪、LCMS-8040 三重四级杆液质联用仪（日本岛津公司）、New Classic MS电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、KQ-500B 型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、HH-6 数显恒温水浴锅（金坛市江南仪器厂）、SHZD(III)循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）、Smart2Pure超纯水机（Thermo-Scientific）。榛子花、大黄、土茯苓等10 味药材均由吉林省北药药材基地提供，经检验均为正品；大黄酸（中国食品药品检定研究院，批号110757-201607，含量：≥99.3%）、大黄素（中国食品药品检定研究院，批号110756-201512 含量：≥98.7%）。甲醇（北京化工厂）、甲酸（天津市光复精细化工研究所）、色谱甲醇（Fisher）、色谱乙腈（Fisher）。

2 方法与结果

2.1 质谱条件 Agilent 5 TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1 mL/min；进样量10 μL；柱温：35 ℃；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～5 min，5% →15% B；5～30 min，15%→35% B；30～40 min，35%→42% B；40～60 min，42%→80% B；离子源：电喷雾（ESI）；检测模式：正负离子检测；扫描方式：MRM 扫描。经分析，浸膏粉中含有大黄酸、大黄素2种成分，见表1。

表1 2种化合物的质谱检测参数

2.2 色谱条件 Agilent 5 TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：254 nm；流速1 mL/min；进样量10 μL；柱温：25 ℃；流动相为0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～3 min，85%→68% B；3～10.5 min，68% B；10.5～13 min，68%→80% B；13～26 min，80% B。

2.3 样品的制备 按比例称取处方中药材共140 g（榛子花、大黄、土茯苓等），分别以不同水提工艺条件进行水煎煮提取，滤过，滤液浓缩，干燥，粉碎，即得。

2.3.1 供试品的制备 取样品粉末2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理1 h，放冷，称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 对照品的制备 精密称取大黄酸、大黄素对照品，加甲醇分别制成每1 mL 含大黄酸、大黄素各80 μg 的溶液，分别精密吸取上述对照品溶液各2 mL，定容至10 mL（每1 mL 含大黄酸、大黄素16 μg），即得。

2.4 煎煮工艺考察

2.4.1 标准曲线的制备 精密称取大黄酸、大黄素对照品，加甲醇制成每1 mL 含有大黄酸分别为8、16、24、32、40、48 μg，含大黄素分别为2、4、6、8、10、12 μg的溶液，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，计算回归方程及相关系数，大黄酸：Y=379 01X+139 61，R2=0.999 0；大黄素：Y=40 580X-476.5，R2=0.999 8。

2.4.2 精密度 精密吸取“2.3.2”项下配置的大黄酸、大黄素混合对照品溶液10 µL，按“2.2”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果，大黄酸和大黄素峰面积的RSD 分别为0.29%、0.32%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性 按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，共6 份，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，大黄酸和大黄素峰面积的RSD 分别为0.42%、0.35%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.4.4 稳定性 取“2.4.3”项下1 号供试品溶液，分别于室温下放置0、3、6、12、24、48 h 后分别进样测定，记录峰面积。结果，大黄酸和大黄素峰面积的RSD 分别为1.67%、0.15%（n=6），表明供试品溶液在室温条件下放置48 h 内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率 取已知大黄酸和大黄素含量的供试品6 份，分别加入大黄酸对照品1.07 mg 和大黄素对照品0.15 mg，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并测定含量，计算回收率。结果，大黄酸、大黄素的平均回收率分别为99.10%、100.04%，RSD 分别为1.06%、1.40%（n=6）。

2.4.6 响应面曲线分析 以煎煮时间（min）、煎煮次数（次）、加水量（倍）为自变量，以大黄酸、大黄素的总提取量为响应值，采用Design-Expert8.0.6 软件，设计得到三因素三水平组合设计试验，每组平行测定2 次，取平均值。因素与水平见表2，试验方案设计及结果见表3。

响应值=大黄酸提取量×50%+大黄素提取量×50%

表2 工艺优化的因素水平

表3 响应面试验方案及试验结果

以方中大黄酸、大黄素的总得率为响应值，用Design-Expert8.0.6 软件对表3 的数据进行二次多项式逐步回归拟合，得到回归方程为，总提取量=3.607 75+6.171A+3.424 5B-0.353C+0.865AB+0.947 5AC-0.088 75BC-4.917A2-0.594 25B2-0.022 313C2，方差分析见表4。由表4 可知，模型P＜0.01；决定系数R2为0.983 1,因素A、AB 有显著性差异（P＜0.05），B、C、AC、A2、B2有极显著差异（P＜0.01），失拟项P＞0.05，表明模型拟合度好，可以用于优化。

表4 方差分析

为评价提取时间与提取次数（AB）、提取次数与加水量（BC）、提取时间与提取次数（AC）交互作用对大黄酸、大黄素总得率的显著影响，及确定各因素的最佳水平范围，分别绘制响应面图和等高线图。确定最优工艺为8 倍量水煎煮2 次，每次1.5 h。

3 讨论

3.1 考察指标的选择 经查阅文献得，总蒽醌中的大黄酸、大黄素在治疗糖尿病肾病的过程中有较好的疗效。通过LC-MS/MS 分析得出，水煎后供试品中大黄酸及大黄素含量较高，故选择以大黄酸、大黄素含量为考察指标优化水提方法。

3.2 质谱和液相试验条件的选择 在LC-MS/MS 中，尝试采用正负离子2种模式，结果显示在负离子模式下离子化效应较好，故选择负离子模式；在HPLC 中，查阅相关文献[8]，确定2种成分在254 nm 处有最大吸收波长，故采用254 nm 作为检测波长。

本文采用Design-Expert 8.0.6 软件对数据进行二次多项式逐步回归拟合，确定的最佳工艺的预测值与理论值的偏差仅为3.29，表明拟合模型合理准确，可用于优选解毒通络益肾浓缩丸水提工艺。