抵当汤对脑出血大鼠eIF2α、p-eIF2α及CHOP 蛋白表达的影响

单慧毓，张冬梅，卢 靖，王 健

（长春中医药大学，长春 130117）

脑出血是临床上常见的脑血管疾病，具体是指颅内血管破裂出血并在脑实质内形成血肿，其对神经功能造成的损害是十分严重的。脑出血发病时间短、进展较快、病情危重，病死率高，且脑出血的病理过程比较复杂[1]。在脑出血病理过程中，神经细胞的凋亡对人体的损害最为严重，而其中的内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS） 通路是目前学者们研究的热点，ERS 通路参与了脑出血后神经细胞凋亡的病理过程。近年来，不断有学者证明，破血化瘀法对脑出血疾病的治疗起到了良性调节的作用，其代表方抵当汤治疗效果显著。刘军莹等[2]经过大量的临床数据整理分析，认为在治疗急性脑出血中，抵当汤加味联合西药组，其临床效果优于单纯应用西药组，这种方法应积极应用于临床脑出血的诊治。本文研究观察抵当汤对大鼠脑出血后eIF2α、p-eIF2α 及CHOP 蛋白表达的影响，探讨抵当汤是否通过干预内质网应激通路而减轻细胞凋亡，从而发挥神经保护作用，为抵当汤治疗脑出血提供实验依据，进而为治疗脑出血后神经细胞凋亡引起的神经损伤寻求潜在治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 研究对象为60 只健康的Wistar 大鼠，质量240～300 g，平均为263.5 g，购买于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。抵当汤新绿色颗粒剂（生大黄5 g，水蛭5 g，桃仁15 g，虻虫5 g），使1 mL药液中含生药1 g（四川新绿色颗粒药业科技发展有限公司），采用传统煎药法，水煎液浓缩，4 ℃ 保存备用。大鼠脑立体定位仪；手持式牙科钻；电热鼓风干燥箱；酶标仪；台式高速离心机；电子天平；微量进样器；电泳仪；转膜仪；匀浆器；一抗；二抗；缓冲液；裂解液；显色液等。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作及给药 参照徐氏等[3]方法造模。首先进行麻醉，向腹腔注射现配的10%的水合氯醛（350 mg/kg）。将大鼠俯卧位固定在立体定位仪上并进行调节，将大鼠门齿固定于门齿钩上，使前、后囟基本在同一水平面上。消毒器具及大鼠头部皮毛，沿正中线切开头部皮肤，暴露冠状缝及前后囟门。按照大鼠脑立体定位图谱，设定前囟为 0 点，在0 点前0.4 mm，中线旁开3 mm 处做标记，用牙科钻钻开一个直径约为1 mm 的小孔，达到硬脑膜表面，注意不要伤及硬脑膜及周围脑组织。用事先准备好的40 ℃温水仔细清洗大鼠尾部，并加热，观察鼠尾，待鼠尾充血后，用75%的乙醇消毒。提取尾动脉，用微量注射器取50 μL 的不抗凝动脉血，将动脉血注入尾状核。伤口进行消毒缝合，均匀涂抹青霉素粉末以防止术后感染。假手术组操作过程同上，但不向尾状核注入自体血，最后，将大鼠尾部用无菌纱布进行包扎、止血。术后人工排尿，清理会阴。正常对照组：自由饮食饮水。假手术组、模型组：生理盐水灌胃，1 mL/100 g，每天1 次；抵当汤低、中、高剂量组：0.13、0.26、0.52 mL/100 g 汤药灌胃，每天1 次。以上大鼠均在麻醉清醒后（约术后3 h）给药，直到喂药到时间点宰杀，离断头颅，开颅，分离海马，取患侧大脑皮层。

1.2.2 大鼠神经功能评分 等待大鼠清醒后，进行行为学分析，采用Longa 评分法[4]进行评价，0 分：大鼠无神经系统功能缺损症状；1 分：左前侧肢体不能完全伸直；2 分：在大鼠行走时，出现转圈的行为；3 分：在大鼠行走过程中，出现向患侧肢体的倾倒现象；4 分：不能自发独立行走，大鼠出现意识丧失的现象。

1.2.3 Western Blot 法检测eIF2α、p-eIF2α 及CHOP 的表达。

1.3 统计学分析 采用Graphpad Prism 5 软件进行统计学分析。采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，以Tukey’s multiple Comparison Test 进行组间比较。

2 结果

2.1 大鼠神经功能评定

2.1.1 一般状态 与假手术组大鼠比较，模型组大鼠进食量明显减少，身体消瘦，一般状态较差，毛色暗淡、无光。与模型组大鼠比较，抵当汤低、中、高组大鼠在给药3 d 后上述症状明显改善。

2.1.2 神经系统体征及神经功能缺损评分 假手术组大鼠未见神经功能缺损的体征，与假手术组大鼠比较，模型组大鼠出现明显的神经系统病理体征，出现偏侧肢体瘫痪，以前肢为重，行走时呈顺时针追尾状。与模型组大鼠比较，抵当汤各组大鼠在给药3 d 后上述症状明显改善，到第7 天基本恢复正常，差异有统计学意义。见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分（）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分（）

注：与模型组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001

2.2 脑含水量测定 与假手术组大鼠比较，在损伤脑组织3 d 后，模型组大鼠脑区含水量明显增加（P＜0.01）。在给药第3 天后抵当汤低、中、高级量组与模型组大鼠比较脑区含水量明显降低，差异有统计学意义，见表2。

表2 各组大鼠脑水肿含水量比较（）

表2 各组大鼠脑水肿含水量比较（）

注：与模型组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与假手术组比较，△△P ＜0.01

2.3 各组大鼠eIF2α、P-eIF2α 及CHOP 蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组的P-eIF2α 及CHOP 蛋白表达量升高（P＜0.01）；与模型组比较，抵当汤组P-eIF2α 及CHOP 蛋白表达量降低，有显著性差异。见图1～图3。

3 讨论

图1 各组大鼠脑组织eIF2α、P-eIF2α 及CHOP 免疫蛋白印迹（western blot）

图2 各组大鼠脑组织CHOP 免疫蛋白表达

图3 各组大鼠脑组织P-eIF2 α 免疫蛋白表达

内质网是一种膜性细胞器，主要与真核细胞中蛋白质合成、折叠与分泌有关。大约有30%的细胞蛋白质在内质网中经过折叠、加工和修饰，形成有活性的功能性蛋白质，如绝大多数分泌蛋白、整合膜蛋白及膜结合蛋白[5-7]。当细胞出现缺血再灌注中损伤、氧化应激损伤、钙离子代谢紊乱及沉积、细胞能量的水平下降、异常的糖基化反应等各种生理和病理因素时，便会产生应激反应，我们称之为内质网应激损伤，这也是近年来分子生物学领域研究热点之一[8]。ER 应激是炎性疾病的主要原因[9]。ICH 后有原发性和继发性的脑损伤，损伤导致细胞代谢受到损坏并且激活一系列应激反应，如内质网应激中的 UPR[10]。一些报道表明，氧化应激[11]，钙离子超载[12]，离子紊乱[13]和毒性物质的释放[14]可能在各种疾病中诱发内质网应激，进而引发细胞凋亡。内质网会激活 PERK-eIF2α 信号通路，导致蛋白质合成的持续减少，进而导致神经细胞凋亡和一些常见的临床疾病[15-16]。在卒中模型中，PERK-eIF2α 蛋白的表达亦显增高的趋势[17]。CHOP 是一种细胞应激的相关蛋白，也是ERS 过程中重要的中间信号分子[18]，当内质网应激的时间过长或者强度过度过高时，ERS 会激活CHOP 信号通路，引起细胞凋亡。有研究者发现CHOP 是内质网应激损伤的直接靶点，CHOP 在NMDA 诱导的损伤的β 细胞中表达增加[19]。近年来，中医药学者经不断实验研究，体外实验证明了抵当汤可通过阻断IRE1 和PERK 信号通路，降低脑出血诱导的内质网应激[20]。另有研究表明，在脑出血急性期，化瘀类中药可以通过促进半暗带脑水肿的吸收而减轻脑水肿，从而减轻细胞凋亡和促进血管内皮的新生，在脑出血病理环节中发挥保护作用[21]。一些学者发现白藜芦醇对早期脑损伤有治疗作用，它可以通过减轻内质网应激从而发挥对神经系统的保护作用[22]。

本实验结果表明，抵当汤可以通过下调eIF2α、p-eIF2α 及CHOP 蛋白的表达，抑制与细胞凋亡相关的信号通路的活化，从而抑制过度的内质网应激损伤，对脑出血半暗带区的神经细胞有保护作用，从而减轻凋亡。