生脉注射液对人鼻咽癌CNE-2细胞抗拒株的放射增敏作用＊

刘诗雅，朱道琦，杨家彬，娄丹丹，高瑞娇，吕 英，范 钦＊＊

（1.南方医科大学中医药学院分子生物实验室 广州 510515；2.南方医科大学南方医院古中医科 广州 510515）

鼻咽癌是我国多发的恶性肿瘤，中国人群的发病率和死亡率明显高于世界平均水平[1]。放射治疗是目前临床首选的治疗手段，但是在临床治疗中发现许多患者存在放射抗拒现象，严重影响放疗疗效及其预后。现有的西药放射增敏剂能够有效提高鼻咽癌的放射敏感性，可是由于存在一定的毒副作用，这些药物的临床应用受到限制[2-3]。因此寻找高效低毒的放射增敏剂成为研究热点。

生脉注射液是经典益气养阴方剂“生脉饮”加工而成的中药注射液，具有益气复脉、养阴生津的功效，能够有效减轻多种癌症放化疗毒副作用和实现放化疗增效，提高患者生活质量[4-5]。在前期研究中，本课题组发现生脉饮组方生脉姜黄散[6-7]、加味生脉散[8]等都对鼻咽癌有放射增敏作用，因此为进一步明确其作为增敏剂的可能性，本研究选用课题组前期成功构建的可稳定表达的鼻咽癌CNE-2细胞放射抗拒株CNE-2R[9-10]作为成熟的放射抗拒模型进行研究，通过体内外实验反映生脉注射液对鼻咽癌的放射增敏作用，并对其增敏作用机制进行初步探讨。

1 材料

1.1 细胞

人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2（中山大学肿瘤防治中心惠赠）。人鼻咽癌放射抗拒株细胞系CNE-2R由本课题组构建。

1.2 SPF级BALB/C-nu裸鼠

4-5周龄，雄性，体重15±3 g，于广东省医学实验动物中心购入，许可证号：SCXK（粤）2013-0002。动物实验开展已通过南方医科大学实验动物伦理委员会批准，批号L2018057。

1.3 药物

生脉注射液（江苏苏中药业集团股份有限公司，批准文号：国药准字Z20053993），细胞给药浓度计算采用有效成分的总质量浓度（ug·mL-1）；动物实验给药浓度按照人和动物体表面积比值表计算出裸鼠等效剂量，并分别以成人正常剂量及其3倍设2个浓度，即低剂量（1.83 g·kg-1）与高剂量（5.49 g·kg-1）。姜黄素对照品（中国曼斯特公司）。

1.4 试剂

RPMI 1640培养基，胎牛血清（美国Gibco公司）；胰酶（吉诺生物医药技术有限公司）；MTT（Sigma公司）；STAT3、p-STAT3、GAPDH单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology（CST）公司）；二抗（美国Earthox公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天试剂有限公司）；ECL发光液（美国Millipore公司）；DAB试剂盒（英国Vision公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

细胞贴壁生长，在37℃、5%CO2、饱和湿度孵育条件下，CNE-2R细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1 640培养液中培养。细胞生长到培养瓶70%-80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

2.2 MTT法检测细胞生长

取CNE-2R对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为5.0×107·L-1，以每孔100µL种植于96孔板，每组细胞设6个平行对照孔。按浓度梯度（0、50、100、150、200、250、300、350、400µg/ml）给予生脉注射液。给药24/48 h后，加5 g·L-1MTT溶液10µL，继续培养4 h，吸去液体，再加入100µL DMSO，振摇10 min。M550酶标仪在490 nm波长下测量每孔的吸光度。根据不同细胞吸光度的均值作出细胞生长曲线。实验重复3次。

2.3 克隆形成实验

取CNE-2R细胞种板后，分别处理孵育48 h后照射（8、6、4、2、0 Gy），换液后继续培养。10-14天后弃去培养液，PBS溶液清洗2次，加入2 mL甲醇，固定30 min，PBS溶液清洗2次，每孔加入2 mL 0.1%的吉姆萨染液染色30 min。蒸馏水洗净晾干，计数所形成的集落数（≥50个细胞数为有效集落），得出集落形成率（PE），根据下列公式计算不同剂量照射下的存活分数（SF），并在GraphPad Prism软件中运用单击多靶模型模型拟合，计算相关放射增敏参数值。实验重复3次。

存活分数（SF）=实验组集落形成率/对照组集落形成率；

集落形成率（PE）=形成集落数/种植细胞数。

2.4 模型建立、分组及给药

42只BALB/C-nu裸鼠适应性喂养3天后随机分为7组，即空白组（A组），生脉注射液低剂量组（B组），生脉注射液高剂量组（C组），生脉注射液低剂量联合照射组（D组），生脉注射液高剂量联合照射组（E组），照射组（F组），姜黄素联合照射组（G组，经本课题组前期研究证明姜黄素对鼻咽癌有放射增敏作用，设为阳性对照组），每组6只。分别将收集好的对数生长期CNE-2R细胞株，用无血清培养基调整细胞密度至5×106个/mL，按相应分组接种0.2 mL肿瘤细胞于裸鼠右大腿皮下。接种后14 d成瘤，第16天开始，各组裸鼠分别给予相关药物干预。A、F组生理盐水腹腔注射（与生脉注射液低剂量组同体积）；B、C、D、E组裸鼠进行生脉注射液腹腔注射；G组用姜黄素灌胃，每组一天一次药物干预。1周后另给予D、E、F、G组X射线照射（照射剂量4 Gy），隔天1次，连续3次。

2.5 移植瘤体积、抑瘤率

隔天测量皮下移植瘤的最大长径（a）和横径（b），计算移植瘤体积V（V=ab2·2-1）。处死动物后无菌剥离瘤体称重，并计算肿瘤体积抑制率和抑瘤率。瘤体体积抑制率=（1-实验组平均瘤体积/空白组平均瘤体积）×100%，抑瘤率=（1-实验组平均瘤质量/空白组平均瘤质量）×100%。

2.6 裸鼠肿瘤组织的HE染色

取处理完成后的各组裸鼠肿瘤于10%甲醛中固定，洗涤脱水后浸蜡包埋制备病理切片，苏木素和伊红染色染色后封片，于200倍光镜下观察各组裸鼠肿瘤组织形态学改变。

2.7 蛋白检测蛋白免疫印迹法

提取总蛋白，采用BCA法定量蛋白浓度，灌制10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳，转膜，封闭，滴加一抗（1∶1 000），4℃过夜，二抗室温孵育（1∶5 000）1 h，曝光显示蛋白表达情况。以GAPDH为内参，应用图像分析系统测定条带灰度值。实验重复3次。

图1 不同浓度生脉注射液对CNE-2R细胞生长的影响

表1 相关放射生物学参数

2.8 统计学处理

所有数据均用SPSS 20.0软件进行统计学分析。裸鼠肿瘤体积采用重复测量的方差分析，处死裸鼠后的肿瘤质量比较、免疫印迹等结果采用单因素方差分析，组间两两比较，方差齐时采用LSD法，不齐采用DunnettT3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 ∶生脉注射液对鼻咽癌CNE-2细胞抗拒株的抑制作用

给药24 h及48 h，都在浓度约50 ug·mL-1之后，随着生脉注射液浓度的增加，其对CNE-2R细胞的抑制作用明显增加，而给药48 h时，则表现出更为明显的抑制趋势。可见生脉注射液对鼻咽癌CNE-2细胞抗拒株的抑制作用呈一定的时间、剂量相关性。在后续实验中，本文选择对鼻咽癌CNE-2细胞抗拒株无明显生长抑制作用时的最大用药浓度（50 ug·/mL-1）作用48 h。见图1

3.2 生脉注射液对鼻咽癌CNE-2细胞抗拒株放射敏感性的影响

克隆形成实验结果采用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，见图2，计算出相关放射生物学参数D0、N、SF2及放射增敏比等，见表1。与单纯放射治疗组相比，生脉注射液联合照射组的D0、N、SF2值均减小，提示用药后细胞抗拒性降低。随着照射剂量的增大，细胞存活分数有较大幅度的降低，放射增敏比为1.484，表明用药后，细胞放射敏感性增加。

3.2.1 裸鼠移植瘤模型建立情况

42只裸鼠接种CNE-2R细胞悬液后，10天成功出瘤，至第14天被接种裸鼠均出现直径为5 mm左右的移植瘤，动物移植瘤模型建立成功。各组移植瘤生长不一，大小不等，裸鼠无明显异常。

3.2.2 生脉注射液对裸鼠移植瘤体积和重量变化的影响

与空白组比较，其余各组的肿瘤体积、瘤质量均受一定程度的抑制，其中生脉注射液低、高剂量组抑瘤率分别为14.46%、13.21%，抑瘤率较低，提示单用生脉注射液有一定抗肿瘤作用但不明显；与单纯照射组（27.14%）相比，生脉注射液低剂量联合照射组（26.96%）抑瘤率无明显差异，而生脉注射液高剂量联合照射组体积抑制率（44.96%）及抑瘤率（37.86%）明显升高，肿瘤对放射治疗敏感性增加。见图3，表2。

3.3 裸鼠肿瘤组织HE染色结果

图2 克隆形成结果示意图

表2 各组处理对人鼻咽癌放射抗拒株细胞CNE-2R裸鼠移植瘤体积以及瘤重的影响（n=6）

图3 各组裸鼠移植瘤组织（n=6）

图4 各组裸鼠移植瘤组织HE染色结果（200X）

可见未经处理的空白组（图4A）的肿瘤生长良好，血管丰富，无明显坏死，细胞核形态大且明显，边缘清晰，细胞膜完整，提示造模成功；单独照射组（图4B）的肿瘤经照射后可见血管减少，部分细胞腔内有空泡形成，细胞核边缘模糊，核质固缩；低剂量中药联合照射（图4C）后，血管减少，细胞变性明显加重，细胞核密度降低，空泡增加；高剂量联合照射（图4D）后可见瘤体组织成片坏死，可见药物可诱导裸鼠肿瘤细胞坏死并呈现一定剂量依赖性。

3.4 生脉注射液对裸鼠移植瘤STAT3、p-STAT3表达的影响

各组肿瘤组织中STAT3、p-STAT3表达具有显著差异。其中与空白组相比，单独照射后肿瘤组织中的STAT3显著上调，药物联合照射后STAT3均下调，以高剂量联合照射组下调最为显著。而与单独照射组比较，用药后各组中p-STAT3表达显著下调，其中具有显著抑瘤作用的生脉注射液高剂量联合照射组中的STAT3、p-STAT3表达均显著下调。提示了STAT3可能参与了生脉注射液在鼻咽癌中的放射增敏过程。见图5。

4 讨论

鼻咽癌患者在接受放疗过程中，存在放射抗拒或者敏感性降低的现象，放射增敏剂的使用提高了临床疗效。近年来，传统中医药开始被越来越多的应用于放疗增敏中，从中医角度分析，放疗后往往会因内损脏腑，伤阴耗气而形成了以气耗阴伤证为主的证型[11]，因此，在放疗过程中，需要对患者进行“养阴益气”的对症治疗。生脉注射液主要成分为红参、麦冬、五味子三味中药中提取的有效成分，如人参皂苷、五味子乙素、五味子醇甲等，具有益气复脉、养阴生津的功效，对于放疗后处于气耗阴伤的患者在临床上取得了良好的增效减毒疗效。有学者发现生脉注射液化疗增敏作用显著，其联合不同化疗药物对多种肿瘤细胞均有明显的增敏作用[12]，李晴等发现生脉散合增液汤加减联合放疗较单纯放疗能够更好地稳定鼻咽癌瘤体，提高NPC患者KPS评分、缓解临床症状，且有效减轻放疗毒副反应[13]。还有研究表明其有效成分人参皂苷Rg3在多种癌症中也具有放射增敏作用,如结肠癌[14]，非小细胞肺癌[15]和食道癌[16]等。此外人参皂苷Rg3被证实可在鼻咽癌、局限期小细胞肺癌等癌种中通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）等与血管生成相关因子的表达水平从而抑制肿瘤血管生成，增强放疗敏感性[17-18]。

图5 生脉注射液对各组裸鼠移植瘤STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响

STAT3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是信号转导与转录激活因子STAT蛋白家族的重要成员。STAT3可以在许多信号通路中被磷酸化激活，是多种细胞信号转导通路的汇聚点，是肿瘤细胞生长、增殖、血管生成和侵袭等过程中重要的参与者,其表达与激活失调和多种肿瘤的发生发展密切相关[19]。近年来，人们发现STAT3的过表达与肿瘤放射抗拒相关，通过抑制STAT3的表达与活化能够增强放射敏感性[20-21]。Gao等人发现柠檬苦素可以通过抑制Stat3转录活性来降低NPC细胞的干性，从而提高鼻咽癌放射敏感性[22]。进一步研究表明，抑制STAT3自身表达和活化可诱导与STAT3相关的肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖及阻断肿瘤血管生成。其中STAT3可直接或间接促进VEGF表达从而促进血管新生，导致放射抗拒[23]。

在本研究中，我们选用了鼻咽癌CNE-2细胞抗拒株作为放射抗拒模型进行研究，通过体内外实验验证了生脉注射液对鼻咽癌的放射增敏作用。为进一步探讨其作用机制，我们将裸鼠移植瘤组织切片进行HE染色观察，发现照射及药物联合照射后，组织内血管减少，肿瘤细胞呈逐步坏死变性改变，具有高抑瘤率的高剂量联合照射组中可见瘤体组织成片坏死并未见明显血管，提示生脉注射液可能抑制瘤体内的血管生成。进一步检测STAT3、p-STAT3蛋白在各组肿瘤组织中表达，与空白组相比，单独照射后肿瘤组织中的STAT3显著上调，药物联合照射后STAT3均下调，以高剂量联合照射组下调最为显著。而与单独照射组比较，用药后各组中p-STAT3表达显著下调，其中具有显著抑瘤作用的生脉注射液高剂量联合照射组中的STAT3、p-STAT3表达均显著下调。提示生脉注射液对人鼻咽癌裸鼠移植瘤放射增敏作用可能与抑制STAT3的表达和活化相关。因此我们推测，生脉注射液可能通过抑制STAT3的表达和活化，阻断STAT3信号通路活化进而阻断了血管生成相关因子的表达，如VEGF等，从而提高了放射敏感性，提高患者治疗疗效。或许这将会是我们继续探索鼻咽癌放射抗拒以及生脉注射液对鼻咽癌放射增敏分子机制新的研究方向。