不同絮凝剂对光合细菌沉降与净水能力的影响

张秀霞 ，张泽龙 ，孙敬锋 ，李军涛 ，王冬梅 ，郑佩华 ，鲁耀鹏 ，冼健安 ，3

（1.天津市水产养殖与生态重点实验室，天津农学院水产学院 天津 300384；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室，海南 海口 571101；3.中国热带农业科学院海南热带农业资源研究院，海南 海口 571101）

光合细菌（Photosynthetic bacteria,PSB）是一类具有光合色素，能在无氧条件下进行光合磷酸化的微生物。其分布广泛，遍及江河、沼泽、湖泊、海洋、池塘及活性污泥和土壤中[1]。PSB最初应用于各类污水处理，后来逐渐引入应用到水产养殖中[2]。PSB在水产养殖上的研究和应用主要集中在调控、改善和稳定养殖水体的水质[3-8]，防治疾病的发生[9]以及利用PSB作为生物饵料和营养性添加剂等[10-11]。在PSB众多的功能中，有关水质净化功能的研究最为深入，应用效果已得到广泛认同，PSB作为天然的微生态制剂，具有安全、高效、经济和环保等优点。目前市场上的PSB净水剂产品繁多，主要以沼泽红假单胞菌为主，但由于缺乏质量标准，产品品质难以保障，存在活菌含量低、菌体活力低等问题，而PSB净水剂的净水效果与菌体的活力密切相关。另外，由于保持较好的活力状态，PSB净水剂产品均为液态产品，运输成本较高。如果可将PSB菌液进行浓缩，同时又保持菌体高活力，则可大大降低成本，有利于促进PSB产品的推广使用以及健康水产养殖模式的发展。张芳蕾等在PSB菌液中添加0.2%预先溶解糊化的海藻酸钠静置絮凝24 h，可得到浓缩10倍的絮凝菌剂[12]。黄业翔应用3%聚合氯化铝（PAC）作为光合细菌絮凝剂，接近70%的光合细菌被絮凝沉降[13]。闫海等比较了4种不同铝絮凝剂对光合细菌的絮凝效果，其中PAC的效果最好[14]。一些学者将PSB进行离心浓缩，再进行固定化后，水质净化效果能够显著提高[15-16]。以往的学者对光合细菌絮凝剂已做了一些初步筛选，但在实际生产中仍未能得到应用。根据化学性质，絮凝剂可大致分为三类：无机絮凝剂、有机絮凝剂和生物絮凝剂，该研究比较三类絮凝剂对光合细菌的絮凝效果，确定适宜的絮凝剂及其适宜浓度与絮凝时间。通过絮凝沉降试验，探讨不同絮凝剂的沉降效果，并对沉降浓缩菌液的活性和净水效果进行分析，筛选高效的絮凝剂，为光合细菌菌液产品的浓缩工艺研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验PSB菌株是本实验室筛选出的沼泽红假单胞菌，其他主要试剂材料：聚合氯化铝（PAC）和聚丙烯酰胺阳离子型（MW：800万，CPAM）购于天津市大茂化学试剂厂，聚丙烯酰胺阴离子型（MW：800万，APAM）购于MREDA，酵母采用进口费曼迪斯S-04艾尔啤酒酵母。

PSB培养基：无水乙酸钠1.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，氯化铵0.5 g/L，七水合硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，磷酸氢二钾 0.3 g/L，氯化钠 1.0 g/L，pH值7.2±0.2。

酵母培养基：蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，酵母膏10.0g/L，pH 值 6.5±0.2。

PSB计数培养基[17]：碳酸氢钠1.0 g/L，无水乙酸钠3.0 g/L，酵母膏2.0 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，Fe-EDTA0.005g/L，氯化铵1.0g/L，六水合氯化镁0.2 g/L，氯化钠 5.0g/L，琼脂粉 18 g/L，pH 值 7.6±0.2。

1.2 四种絮凝剂的沉降效果试验

1.2.1 光合细菌和酵母菌的活化 PSB培养基121℃，灭菌20 min，按20%接种量接种PSB菌液，于30℃，光强2 300 lx的智能光照培养箱中培养72～96 h，测OD660值为1.6～1.8，备用。酵母培养基121℃，灭菌20 min，按2%接种量接种酵母干粉，于27℃，250 r/min的摇床中培养72～96 h，菌液分装至无菌离心管中，6 000 r/min离心5 min，去掉上清液收集沉淀，收集的沉淀用0.9%无菌生理盐水洗涤2次。

1.2.2 絮凝剂沉降试验 絮凝剂按要求称量好，加入1L PSB菌液中充分搅拌使之完全溶解，溶解完毕取样检测OD660值，并将菌液倒入imhoff漏斗中静置，观察沉降效果，记录沉降到目标时间沉降菌液体积，检测上清液的OD660，计算絮凝率。根据实际静置絮凝情况，PAC和CPAM组静置絮凝1 h，APAM和酵母菌组静置絮凝10 h。每组设置3个平行。

絮凝率=（混合均匀菌液OD660-上清液OD660）/混合均匀菌液OD660×100%

1.3 模拟养殖废水培养液的配制

1.3.1 饲料浸出液母液 取市场上购买的对虾饲料50 g加1 L海水，海水盐度30，4℃冰箱浸泡过夜，用200目尼龙筛过滤3次，121℃，灭菌20 min，备用。

1.3.2 模拟养殖废水培养液配制取 养殖废水，要求氨氮与亚硝酸盐在目标值以上，121℃，灭菌20 min，备用。用上述饲料浸出液母液加养殖废水稀释，配制成目标培养液，分装至三角瓶，每瓶加400 mL培养液，121℃，灭菌20 min，备用。

1.4 沉降后的菌体活性测定

PSB计数培养基121℃，灭菌20 min，倒平板备用。根据1.2的结果选择合适的絮凝剂及浓度进行试验，方法同1.2，沉降到目标时间后用移液器小心吸出上清液，取底部沉降菌液检测OD660，并将底部沉降菌液稀释到合适倍数平板涂布检测活菌数，每组设置3个平行。

1.5 沉降后的菌体净水能力的测定

分别取不同浓度PAC沉降1 h的菌液20 μL添加至400 mL模拟养殖废水中，添加20 μL未加絮凝剂的PSB菌液作为阳性对照组，不添加PSB菌液作为阴性对照组。每组设置3个平行。COD、氨氮和亚硝酸盐均采用Lovibond水质分析仪及相应试剂盒进行测定。

COD 去除率=（初始 COD-检测 COD）/初始COD×100%；

氨氮去除率=（初始氨氮-检测氨氮）/初始氨氮×100%；

亚硝酸盐去除率=（初始亚硝酸盐-检测亚硝酸盐）/初始亚硝酸盐×100%。

2 结果

2.1 四种絮凝剂的沉降效果

PSB菌液中添加PAC后，菌液迅速形成絮状物并开始分层，絮状物快速聚集沉降，随着PAC浓度的增加，上清液颜色越来越淡，沉降菌液体积越来越大。PSB菌液中加入CPAM后，迅速形成较大块的絮凝物，菌液变粘稠，絮凝物或沉于底部或粘附于imhoff漏斗壁或悬浮于液体中，晃动imhoff漏斗悬浮的絮状物会逐渐沉于底部。PSB菌液中加入APAM后菌液变粘稠，有小絮状物悬浮于菌液中但不沉降，底部有黏液状透明物。PSB菌液中加入酵母菌后，菌液变浑浊，有颗粒状絮凝物漂浮在菌液中，随后缓慢沉降。四种絮凝剂对PSB的沉降效果如图1。

加入PAC、APAM、酵母菌3种絮凝剂混合均匀后，OD值与对照组相比，均有不同程度的增加，其中添加酵母菌后，菌液变浑浊，OD值增加最大；添加CPAM混合均匀后，菌液迅速絮凝成块状物，菌液OD值降低。结果如表1，静置30 min后，PAC组的沉降效果已十分明显，最高絮凝率为96.13%；CPAM组也有明显的沉降，最高絮凝率为39.06%，APAM和酵母菌组的沉降不明显。与静置沉降30 min相比，1 h后PAC和CPAM组的絮凝率有所增加，絮凝率最高分别为96.86%和42.20%。APAM组和酵母菌组的沉降时间延长至10 h，絮凝率为3.52%和34.96%。四种絮凝剂的絮凝率均随絮凝剂添加浓度上升而增加。综合总体情况，絮凝效果最好为浓度2 000 mg/L的PAC，静置时间30 min。

2.2 PAC沉降浓缩菌液的菌体活性

根据2.1的结果，絮凝剂PAC对PSB的沉降效果最好，因此挑选PAC沉降浓缩1h的菌液进行活菌浓度测定，结果如表2，随着PAC添加量的上升，菌液的OD660下降，活菌浓度也相应减少。500 mg/L的PAC组的活菌浓度最高，是对照组的19.9倍。菌液OD660和活菌浓度进行相关性分析，结果如图2，菌液OD660和活菌浓度呈显著的正相关线性关系，相关性系数R2=0.989。

2.3 PAC沉降浓缩菌液的净水效果

取添加不同浓度PAC沉降浓缩1 h后的菌液进行净水效果试验，结果如图3～图6。没有添加菌液的阴性对照组在5 d的试验期内COD、氨氮和亚硝酸盐均没有显著变化。添加非浓缩菌液的阳性对照组和PAC沉降浓缩菌液的试验组，COD均持续下降，前48 h下降迅速，而后逐渐趋缓。500 mg/L和1 000 mg/L的PAC浓缩菌液组的COD降解速度较快，阳性对照组降解速度最慢。120 h后，各PAC浓缩菌液组之间的COD去除率差异无统计学意义，均显著高于阳性对照组（图3）。

表1 絮凝剂对光合细菌的絮凝效果

表2 PAC絮凝沉降1 h后浓缩菌液的OD值与活菌浓度

图2 PAC沉降1 h后浓缩菌液的OD660和活菌浓度的线性关系

阳性对照组和PAC沉降浓缩菌液组的氨氮含量均呈现先升高后下降的趋势。阳性对照组氨氮含量在前72 h上升，96 h开始下降。PAC沉降浓缩菌液组氨氮含量在前48 h上升，72 h开始下降。120 h后，500 mg/L、1 000 mg/L和 1 500 mg/L的 PAC 浓缩菌液组的氨氮含量略低于初始值，其中500 mg/L的PAC浓缩菌液组的氨氮去除率最高，2 000 mg/L的PAC浓缩菌液组的氨氮含量恢复到初始值水平，阳性对照组的氨氮含量仍显著高于初始值（图4）。

阳性对照组和PAC沉降浓缩菌液组的亚硝酸盐含量均持续下降，且在48 h时亚硝酸盐含量均已降至0.1 mg/L以下。前24 h，PAC沉降浓缩菌液组的亚硝酸盐降解速度显著高于阳性对照组（图5）。

3 讨论

3.1 不同絮凝剂对PSB的沉降效果

图3 PAC沉降菌液对COD的降解效果

图4 PAC沉降菌液对氨氮的降解效果

PAC是新型无机高分子絮凝剂，在水中发生水解反应生成中间产物，水体中的细微颗粒或胶体污染物在中间产物的作用下进行吸附电中和、吸附架桥或吸附卷扫等作用，使这些细微物质脱离稳定状态，生成粗大的絮凝体，从而沉降下来[18]。该试验中，PAC加入液相后，快速水解成Al(OH)3，在水中与PSB菌体所带的负电荷瞬间产生中和作用而迅速絮凝，并进一步架桥生成大絮团而快速沉降。

图5 PAC沉降菌液对亚硝酸盐的降解效果

PAM为人工合成有机高分子絮凝剂，按其所带电荷属性可分为阳离子型、阴离子型、非离子型、两性型四种类别，PAM絮凝主要通过电中和、吸附架桥或吸附卷扫等，使颗粒聚成较大的絮体，进而沉降[19]。PSB培养基pH值在7.4～8.0之间，大于氨基酸等电点，所以其表面带负电荷，而该试验中所用CPAM带正电荷，与PSB能通过电中和吸附等作用形成较大絮凝体进而沉降；APAM带负电，与PSB不能产生电中和作用，故只有小絮凝物，无法沉降。

絮凝是酵母的可遗传特性之一，絮凝特性受絮凝基因控制，不同种酵母絮凝性不同[20]。酵母细胞壁上的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和N-乙肽葡萄糖胺等成分均可用作絮凝剂。微生物絮凝机理被广泛接受的主要有吸附架桥、吸附-电中和、沉析物网捕等[21-22]。该研究结果显示，添加酵母对PSB具有一定的絮凝沉降作用，但效果较差，且所需的时间较长。

图6 PAC沉降菌液的COD、氨氮和亚硝酸盐去除率

比较4种絮凝剂，PAC对PSB的絮凝沉降效果最佳，沉降迅速，时间短。各类絮凝剂的添加浓度越高，絮凝率越高。PAC添加量为2 000 mg/L时，30 min的絮凝率即可达到96.13%。

3.2 PAC絮凝沉降对光合细菌菌体活力的影响

PAC添加量越高，絮凝率越高，但从表2可见，浓缩菌液中的菌体活力呈现了相反的趋势，即单位体积菌液的活菌数量反而减少。在絮凝沉降过程中发现，PAC添加量越高，絮凝物沉淀部分的体积也越大，但结构变得松散，这可能是活菌浓度反而下降的主要原因；另外，PAC添加量是否对PSB产生毒性影响而降低活菌浓度，仍有待进一步研究。根据活菌浓度，PAC添加量以500 mg/L为宜，经浓缩后活菌浓度可达到原来的19.9倍。

3.3 PAC絮凝沉降对光合细菌净水能力的影响

研究结果显示，该试验所用的PSB菌株对水体COD和亚硝酸盐均有很强的降低能力，而氨氮则呈现了先升高后下降的趋势。PSB既能利用无机氮源也能利用有机氮源，但菌体不能直接利用有机氮源，有机氮源需转化为NH4+才能为细菌所用[23]。该研究结果表明，该菌株优先分解利用有机氮源，转化有机氮源为NH4+，导致氨氮含量在试验前期上升。48 h后，PAC浓缩菌液使COD降解约50%，此时COD的下降趋于缓慢，氨氮含量也开始下降。与未经浓缩的菌液对比，PAC浓缩菌液的COD降解速度略优，而氨氮含量由上升转为下降则提前了24 h。在120 h后，阳性对照组的氨氮含量仍高于初始值，PAC浓缩菌液组的氨氮含量已恢复或低于初始水平。

亚硝酸盐是水体主要毒性污染物之一，它对水产动物的危害主要表现在其会氧化水产动物体内的亚铁血红蛋白成为高铁血红蛋白，减弱血红蛋白的携氧能力，使水产动物缺氧[24]。光合细菌降解亚硝酸盐是通过自身的代谢特征，将亚硝酸盐转化为硝酸盐，试验证明此菌株有很强的亚硝酸盐降解能力，未经浓缩和PAC浓缩的菌液均在48 h时将亚硝酸盐降解完毕。但从24 h数据可看出，经过PAC浓缩的菌液的亚硝酸盐降解速度优于未经浓缩菌液。

对不同PAC添加量浓缩的菌液进行比较发现，500 mg/L和1 000 mg/L的PAC浓缩菌液组的COD降解速度略优于其他PAC添加量浓缩菌液组，500 mg/L的PAC浓缩菌液组的120 h氨氮去除率最高。这些结果与浓缩后菌体活力的检测结果相一致，500 mg/L的PAC浓缩菌液的活菌浓度最高，因而净化能力也较强。虽然提高PAC的添加量，能够提高絮凝率，但活菌浓度以及净水能力反而下降，因此建议选用PAC作为PSB沉降浓缩的絮凝剂，添加浓度以500 mg/L为宜，沉降浓缩时间为1 h。