南繁地区筛网用于转基因玉米种植隔离距离控制条件的研究

谭燕华 谢翔 周霞 易小平 霍姗姗 张丽丽 曹扬 赵辉 郭安平

摘  要：筛网作为控制基因漂移的物理隔离屏障早已应用在农业生产中，然而一直缺乏可靠的试验数据供选择。因此，本研究使用筛网作为隔离措施，研究南繁地区转基因玉米基因漂移距离的控制条件，研究期为2 a，分别在2个南繁季节和2个南繁地点进行。结果显示：在基因漂移阈值为0.1%的条件下，250目的筛网在高度高于种植的玉米2.5 m时，可有效地将花粉漂移距离控制在20～30 m，大大缩短了转基因玉米安全监管规定的隔离距离，这对于农用土地越来越少的南繁基地是非常有利的。本研究结果也可适用于南繁地区常规玉米制种过程的基因漂移风险控制。

关键词：筛网;转基因玉米;基因漂移;隔离控制;南繁

中图分类号：S513      文献标识码：A

Using Screen Mesh to Control the Isolation Distance of Transgenic Maize Planted in Off-Season Reproduction Regions

TAN Yanhua， XIE Xiang， ZHOU Xia， YI Xiaoping， HUO Shanshan， ZHANG Lili， CAO Yang，

ZHAO Hui， GUO Anping*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Screen mesh has been used as a physical barrier isolation material to control the pollen flow in agricultural production for a long time， but there has been little reliable experimental data for the application. A physical isolation facility using screen mesh to isolate transgenic maize from non-transgenic maize was studied for two seasons 2015 and 2016. and at two different planting areas in Hainan Island. Screen mesh with 250 mesh and height of 2.5 m above the height of transgenic maize was good enough to prevent pollen flow at a critical distance of 20–30 m， when the threshold valve of genetic drift rate was set as 0.1%， which greatly shortened the isolation distance stipulated by the safety control of GM maize， and this was quite beneficial for Off-Season breeding due to the dwindling agricultural land. The study is also applicable to the gene flow risk control of traditional crops in Off-Season breeding areas during seed production process.

Keywords： screen mesh; transgenic maize; genetic drift; isolation control; Off-Season breeding

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.002

海南省南部的三亚、乐东、陵水三市县及周边地区为典型的热带气候，为动植物周年生长繁殖提供了优越的生态条件，吸引着全国各地的科技工作者来开展农作物反季节育种、繁殖和生產工作，以三亚、陵水、乐东等地为核心区构成的南繁区域已经成为我国重要的育种基地，而随着海南南部可用耕地的减少，南繁区域逐渐北移，临高、文昌等地也开始进驻南繁单位。目前全国已有29个省、市、自治区开展南繁育种工作，每年冬季约有700多家科研单位、种子企业进驻南繁，驻点南繁的科技人员每年有5000多人，部分年份多达上万人。近年来，随着转基因作物研究开发的飞速发展，我国的转基因作物新品种培育工作也快速发展，进入南繁地区的转基因材料日益增多。鉴于南繁的特殊性，南繁地区的转基因生物安全备受关注。转基因作物的外源基因如果在南繁地区漂移至其他种质材料，就可能迅速扩散到全国各地，其潜在风险高于全国其他地区。如不科学规范管理，南繁地区可能成为外源转基因漂移的“扩散源”，势必影响我国农作物生产、生物多样性保护和生态安全。随着海南国际旅游岛的开发和城市化进程加快，南繁基地面临用地紧张、管理不顺等一系列问题。为了使转基因作物和非转基因作物在南繁区域能够同时种植，开展南繁基地转基因农作物安全防控措施技术研究已成为当今转基因生物安全执法管理中最紧迫和必须优先解决的问题。

玉米是异花授粉植物，风媒传粉，异交率较高。转基因玉米花粉可通过释放和扩散，向其他非转基因玉米或近缘植物转移或飘落，引发对生物多样性、环境安全、生态系统的潜在风险。基因漂移的漂移频率及扩散距离与玉米扬花时期的气象条件有直接关系，不同地方研究得出不同的玉米基因漂移距离各不相同，不同研究者得出的结果差别较大[1-5]，而花期隔离的天数6 d以上时，基因漂移距离将明显缩短[6]。目前，对玉米基因漂移的控制措施主要是空间隔离、时间隔离和物理屏障隔离等。有关机构对隔离距离的具体规定各不相同，SCIMAC（Supply Chain Initiative on Modified Agricultural Crops）规定饲用玉米制种时的隔离距离为80 m，甜玉米为200 m[7];OECD（Organization for Economic Co-operation and Dev el o pment）规定玉米制种时的隔离距离为200 m[8]。在我国目前农业转基因生物安全监管配套规章中，推荐的玉米空间隔离距离为300 m，花期隔离为30 d[5]。物理屏障隔离包括自然屏障隔离、高杆作物隔离和隔离布隔离等，其中隔离筛网或隔离布作为防控屏障一直是中国小面积制种或育种中应用最为普遍的防控外源基因漂移的屏障技术。研究表明，隔离布能降低转基因水稻花粉向非转基因水稻漂移的风险[9]。一方面，由于进驻南繁的单位多而可用耕地面积越来越紧张，制约了空间隔离的条件;另一方面，南繁季节性明显、时间有限，进行花期隔离势必影响到生产的需求，因此许多南繁单位多采取简便易行的物理屏障隔离的控制措施，但其防止基因漂移的真实效果目前尚没有系统的实验验证，有必要对屏障的隔离效果进行试验分析，以丰富基因漂移的研究成果，为转基因作物的商业化生产中隔离措施的应用和效果评估提供依据，同时为生产中的繁殖、制种的隔离措施的应用提供技术支撑。

本研究以我国自主研发的转植酸酶基因玉米[10]为材料，选择筛网为隔离设施，研究小面积种植转基因玉米基因漂移的控制条件，建立一套高效、简便且能够为南繁地区转基因玉米在转基因转化体、相关材料的田间试验操作过程中控制基因玉米基因漂移的控制技术与操作规范;在基因漂移率为0.1%许可条件下，期望能够将转基因玉米与非转基因玉米种植的隔离距离降低到20～30 m之间[11]，减少原先的大时空隔离（300 m空间间隔、30 d以上时间间隔）对土地的浪费，提高育种工作的效率与产出。

1  材料与方法

1.1  材料

在研究玉米基因漂移时一般选择种子颜色作为标记[12-16]，玉米胚乳的黄色对白色为显性[17]。本研究采用转植酸酶基因玉米品种作为转基因材料，该品种为黄色籽粒，由北京奥瑞金种业股份有限公司提供;白色籽粒的常规玉米金科糯2000被作为非转基因玉米花粉受体材料，购于海南绿川种苗有限公司。

1.2  试验设计

2015—2016年的南繁季节在南繁核心区和非南繁核心区2个地方开展了转基因玉米花粉的基因漂移防控试验。南繁核心区为三亚市乐东黄流镇（108°47′51″ E，18°31′27″ N）、非南繁核心区为文昌市迈号镇（110°45′42″ E，19°32′18″ N），2个地方都分别进行了2次试验。试验地周边均为非玉米种植区，乐东黄流镇试验地周边主要种植水稻、瓜菜等农作物;文昌市迈号镇试验地周边主要为椰树林、荒地。

本研究采用筛网作为物理隔离措施来控制外源基因漂移。试验所用的筛网孔径分别为150、200、250目;同时以筛网高度高于转基因玉米植株的相对高度1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 m来进行隔离高度控制试验。每个试验小区为105 m× 105 m，在中央（5 m×5 m）種植转基因玉米，其余面积种植常规玉米（图1）。播种后按当地常规的水肥管理;为使转基因玉米和常规玉米花期相遇，转基因玉米分别在常规玉米种植的前7 d、同一天、后7 d分3批种植。在开花前将转基因玉米用不同目数、不同高度的网筛隔离起来，上不封顶。同时设置1个相同种植面积的对照小区（CK），种植方法相同，但中间的转基因玉米在整个生育期不用防虫网隔离。为防止各小区之间发生传粉，在玉米扬花期用6 m高透明薄膜将不同小区隔离。

图中间的小正方形为5 m×5 m转基因玉米种植区，其余面积种植常规玉米。玉米成熟后分别延转基因玉米的东南、东北、西南、西北4个方向收集玉米果穗。

The small square in the middle of the picture is the genetically modified （GM） maize planting area， and the rest area is planted with conventional maize. After maturation， maize ears were collected along four directions （i.e.， southeast， northeast， southwest and northwest） of GM maize respectively.

1.3  气象数据

在玉米生长期用便携式气象站（Watchdog 2900ET，UAS）记录风速和方向。瞬时风速记录精度为±0.8 m/s，数据记录器每15 min存储一次气象数据的平均值[15]。

1.4  玉米花粉扩散频率与距离

在玉米进入成熟期后，分别沿转基因玉米的东南、东北、西南、西北4个方向，在离转基因玉米1、3、5、10、15、20、25、30、40、50 m处随机各收取20个常规玉米果穗（第1果穗）[18]，分别计数黄色和白色种子数，计算基因（花粉）漂移频率。

漂移频率=（调查株果穗黄色籽粒数/调查株果穗总籽粒数）100%

同时，记录每个方位花粉扩散的最远距离，以计算平均扩散距离。根据基因漂移率1%或0.1%的临界阈值来分析最远基因漂移距离。

2  结果与分析

2.1  非南繁核心区筛网隔离条件下转基因玉米花粉扩散的最远距离

非南繁核心区文昌地区第1次试验玉米种植于2015年1月，玉米扬花期在2015年3月。此时的风向主要为东南风，77.3%的风速为1.6～ 3.3 m/s，最大风速为9.6 m/s（表1，图2A）。在基因漂移阈值为1%时，3种孔径筛网150、200、250目的隔离效果都较好，转基因玉米花粉漂移最远距离都在1 m内。没有隔离设施的对照（CK）的最远漂移距离在下风方向（西北方向），为10 m。当基因漂移阈值为0.1%时，对照的最远漂移距离在2个下风方向（NW、NE）都超过了50 m，而在3种孔径筛网隔离条件下，花粉漂移最远距离都在3～5 m范围内（表2，文昌1）。此次试验转基因玉米花粉漂移距离和频率不大，这可能与扬花期主要为雨天有关，因此花粉都漂移不远。

第2次试验材料种植于2015年11月，玉米扬花期在2016年1月。受强冷空气影响，气温大幅降温且风速增大，此时的风向主要是东北风，78.7%的风速为3.4～7.9 m/s，最大风速达18.3 m/s（表1，图2B）。受大风影响，此次试验转基因玉米花粉漂移距离和频率均大于第1次试验结果。当基因漂移阈值为1%时，在150、200目筛网隔离条件下，转基因玉米花粉漂移最远距离为3～ 5 m;250目筛网隔离条件下转基因玉米花粉漂移最远距离为1～3 m，没有隔离设施的对照（CK）花粉漂移最远距离为5～10 m;而当阈值为0.1%时，150、200目筛网隔离条件下转基因玉米花粉漂移最远距离为40 m，250目筛网隔离条件下为15～20 m，而CK的最远漂移距离在各个风向都超过了50 m（表2，文昌2）。

2.2  南繁核心区筛网隔离条件下转基因玉米花粉扩散的最远临界距离

本研究同时在南繁核心区域乐东进行了筛网隔离条件下转基因玉米花粉向常规玉米扩散的最远临界距离试验。第1次试验材料种植于2015年11月，玉米扬花期在2016年1月，试验期间平均温度高于同一时期文昌地区，此时的风向主要为西南风，风速主要在0.3～1.5 m/s之间，最大风速为7.2 m/s，西南风（表1，图2C）。当阈值为1%时，在150目筛网隔离条件下，转基因玉米花粉漂移最远距离为20～25 m;200目的花粉漂移最远距离为10～15 m;在250目筛网隔离条件下转基因玉米花粉漂移最远距离为3～5 m，CK花粉漂移最远距离为30 m;而当阈值为0.1%时，在CK、150目、200目筛网隔离条件下转基因玉米花粉漂移最远距离在各个风向均超过50 m，在250目筛网隔离条件下转基因玉米花粉向常规玉米漂移最远距离为15～20 m（表2，乐东1）。

本研究在完成第1次试验后，在同一块试验地进行了第2次重复试验。试验材料种植于2016年3月，玉米扬花期在2016年4月底到5月初，试验期间平均温度高于文昌地区，此时的风向主要为东北风，风速主要在1.6～3.3 m/s之间，最大风速为13.4 m/s，其次为东南风，西北风（表1，图2D）。当阈值为1%时，在150目筛网隔离条件下，转基因玉米花粉漂移最远距离为20～25 m;200目的花粉漂移最远距离为15～20 m;在250目筛网隔离条件下，下风方向转基因玉米花粉漂移最远距离为10～15 m，逆风方向为1～3 m;CK花粉漂移最远距离下风方向30 m，逆风方向为15 m。而当阈值为0.1%时，在CK、150目筛网隔离条件下转基因玉米花粉漂移最远距离在各个风向均超过50 m，在200目筛网隔离条件下转基因玉米花粉漂移最远距离大于40 m;在250目筛网隔离条件下转基因玉米花粉漂移最远距离下風方向为20～25 m，逆风方向为1～3 m。（表2，乐东2）。

2.3  不同高度筛网隔离条件下转基因玉米花粉扩散的最远临界距离

本研究在文昌和乐东对筛网防控转基因玉米花粉漂移的隔离高度进行了试验。在前期试验基础上，选择250目筛网作为研究对象，分别研究筛网高度高于转基因玉米株高的1.5～3.5 m时转基因玉米花粉漂移的最远临界距离。非南繁核心区文昌的试验材料种植于2015年11月，玉米扬花期在2016年1月;南繁核心区乐东的试验材料种植于2016年3月，玉米扬花期在2016年4月底到5月初。气象资料如前所述（表1）。由于环境因素的影响，2个试验点种植相同玉米的高度不同，导致实际隔离高度不一致。因此，以筛网高度减去玉米植株高度作为相对隔离高度，来研究筛网高度高于转基因玉米植株的适宜高度。文昌生长的玉米株高约为1.5～2.0 m，乐东生长的玉米株高约为2.0～2.5 m，文昌的玉米株高低于乐东生长的玉米株高。因此，虽然选择了同样高度的筛网，但是文昌隔离高度控制试验的相对隔离高度为1.5、2.5、3.5 m，而乐东的相对隔离高度为2.0、2.5、3.0 m。文昌隔离高度控制试验结果表明，在基因漂移率阈值为1%的条件下，3个相对隔离高度均可将花粉漂移距离控制在3 m以内。在0.1%阈值条件下，当相对高度为1.5 m时，各方向的漂移距离大于40 m;当相对高度为2.5 m时，各方向的漂移距离可控制在20 m以内;当相对隔离高度为3.5 m时，逆风（西北和东北）方向的漂移距离可控制在10 m以内，而顺风方向达到25 m（表3，图3A，图3B，图3C）。乐东隔离高度控制试验结果表明，当阈值为1%时，3个相对隔离高度在各个方向均可将花粉漂移距离控制在20 m以内。当阈值为0.1%时，在逆风方向（东南、东北）3个相对隔离高度均可将漂移距离控制在20 m以内;而顺风方向，相对隔离高度为2 m时，在40 m处仍监测到高于0.1%的漂移率;相对隔离高度为2.5 m时，可将漂移最远距离控制在25 m以内;相对隔离高度为3 m时，在40 m处仍监测到高于0.1%的漂移率（表3，图3D，图3E，图3F）。

3  讨论

為了让转基因作物与非转基因作物共存，有必要在风险控制中引入阈值管理原则[19]，规定一个安全的阈值，以确保在一块给定的农田上，转基因作物的存在不影响农民自由种植其他任何类型的农作物[20]。OECD设置此阈值为0.9%[21]，但允许成员国在特定的供应环节采用更低的阈值，如法国贴有“GM-free”标签的阈值设置为0.1%。我国转基因玉米建议以0.1%的阈值距离作为转基因玉米的安全监管底线，玉米的隔离距离应在300 m左右[22]。本研究也是基于0.1%的阈值开展试验的。

现实生产中常常选择筛网作为控制花粉漂移的隔离材料。筛网作为隔离材料，搭建简单、方便，为了不影响作物的正常生长和农业管理，可以只在作物的生育期使用，这对于台风较多的沿海地区还可以降低台风侵袭概率。另外，在生产中还发现，有筛网隔离收获的玉米比没有筛网隔离收获的玉米受的虫害要少，产量更高。

250目大小的筛网可以有效地控制转基因玉米花粉漂移的最远临界距离。新鲜玉米花粉近圆形或椭圆形，直径74.5～85 μm，少数为100～ 120 μm[23]，本研究选择150目（106 μm）、200目（75 μm）、250目（58 μm）的筛网作为试验对象。玉米花粉的扩散频率和距离与玉米扬花期时的天气有密切关系，特别是与风速有直接的关系。本研究分别在南繁核心区乐东和非南繁核心区文昌对不同尺寸的筛网控制玉米花粉漂移距离进行了为期2年的试验，试验期间两地风速最大达到了18.3 m/s（文昌）。结果表明，试验所用各尺寸的筛网可以显著降低花粉的漂移频率，并缩小花粉漂移的最远距离。基因漂移率阈值为1%时，试验条件下，试验所用筛网均可将花粉漂移的最远临界距离控制在20 m内;基因漂移率阈值为0.1%时，150目和200目筛网不能将最远漂移距离控制在期望范围内，甚至在平均风速较大的乐东地区，与CK一样最远漂移距离超过50 m;而250目的筛网可以将最远临界距离控制在期望20～ 30 m内，大大缩短了隔离距离。由于我国对转基因的监管阈值为0.1%，所以应考虑250目以上的筛网来作为转基因玉米基因漂移的隔离防控措施。

250目筛网有效控制玉米花粉漂移的适合高度是高于株高2.5 m。本研究中试验筛网采用Φ32 mm×1.8 mm×6000 mm的活动钢管固定在田间。试验中，分别对筛网高度高于转基因玉米植株1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 m的相对高度进行了隔离高度控制试验。玉米基因漂移隔离高度试验表明，相对隔离高度为2 m时，花粉易于被大风从筛网上空带出来，以至于在较远的距离有较大的漂移，特别是在迎风方向，基因漂移率为0.1%的阈值时，最远临界距离甚至超过50 m;相对隔离高度为3 m时，由于玉米的株高常常达到3 m左右，这样筛网的高度将达到6 m，试验期间发现这个高度在大风的吹刮下，筛网易于被吹破、吹倒，不利于基因漂移的防控;相对隔离高度为2.5 m时，不仅可以有效地将花粉漂移距离控制在本研究期望的范围内，抗风能力也强，在2个试验基地的试验期间气象条件下，没有被刮倒过，因此这个高度是适用于南繁条件下的隔离高度。

南繁地区是我国重要的育种基地，目前进入南繁地区的转基因玉米材料日益增多，主要是进行材料加代和亲本扩繁，需要的种植面积较小。筛网作为控制基因漂移的物理隔离屏障，早已应用在农业生产中，然而一直缺乏可靠的试验数据供选择。本研究针对我国南繁地区的气候地理条件，研究了转基因玉米基因漂移风险控制的条件。在南繁条件下，对于小面积种植的转基因玉米，在基因漂移率阈值为0.1%的条件下，选择尺寸为250目、相对隔离高度为2.5 m的筛网，可以有效地控制转基因玉米花粉漂移的最远临界距离在20～30 m内，大大缩短了我国对转基因玉米安全监管规定的隔离距离，这对于农用土地越来越少的南繁基地是非常有利的。本研究结果也可以适用于南繁地区常规玉米等高杆作物的制种过程的基因漂移风险控制;也可以为南繁地区其他作物的基因漂移风险控制提供参考。其他地区转基因玉米与传统作物玉米共存的小面积种植，需要综合考虑当地的气候、农艺和环境因素[16， 24]。当大面积种植转基因玉米时，应选择空间隔离300 m左右。

参考文献

路兴波， 孙红炜， 杨崇良， 等. 转基因玉米外源基因通过花粉漂移的频率和距离[J]. 生态学报， 2005（9）： 2450-2453.

Goggi A S， Caragea P， Lopez-Sanchez H， et al. Statistical analysis of outcrossing between adjacent maize grain production fields[J]. Field Crops Research， 2006， 99（2）： 147-157.

Bannert M， Stamp P. Cross-pollination of maize at long distance[J]. European Journal of Agronomy， 2007， 27（1）： 44-51.

Devos Y， Demont M， Dillen K， et al. Coexistence of genetically modified （GM） and non-GM crops in the European Union： a review[J]. Agronomy for Sustainable Development， 2009， 29（1）： 11-30.

敖光明， 王志兴， 王旭静， 等. 主要农作物转基因飘流频率和距离的数据调研与分析Ⅳ. 玉米[J]. 中国农业科技导报， 2011， 13（6）： 27-32.

Della Porta G， Ederle D， Bucchini L， et al. Maize pollen mediated gene flow in the Po valley （Italy）： source-recipient distance and effect of flowering time[J]. European Journal of Agronomy， 2008， 28（3）： 255-265.

Weekes R， Allnutt T， Boffey C， et al. A study of crop-to-crop gene flow using farm scale sites of fodder maize （Zea mays L.） in the UK[J]. Transgenic Research， 2007， 16（2）： 203-211.

OECD. Maize and sorghum seed moving in international trade[R/OL]. 2007. [2019-04-20]. http：//www.oecd.org/ data o ecd/ 41/0/15290084.

周業娴， 刘寿东， 胡  凝， 等. 基于隔离布防护的水稻冠层上方风速分布特征[J]. 中国农学通报， 2011， 27（21）： 28-31.

Chen R M， Zhang C Y， Yao B， et al. Corn seeds as bioreactors for the production of phytase in the feed industry[J]. Journal of Biotechnology， 2013， 165（2）： 120-126.

Nadal A， Pla M， Messeguer J， et al. Asynchronous flowering or buffer zones： technical solutions for small-scale farming[J]. EuroChoices， 2016， 15（1）： 24-30.

Garcia C， Figueroa M， Gomez L， et al. Pollen control during transgenic hybrid maize development in Mexico[J]. Crop Science， 1998， 38（6）： 1597-1602.

Jemison J J， Vayda M E. Cross pollination from genetically engineered corn： wind transport and seed source[J]. AgBioForum， 2001（2）： 87-92.

Stevens W E， Berberich S A， Sheckell P A， et al. Optimizing pollen confinement in maize grown for regulated products[J]. Crop Science， 2004， 44（6）： 2146-2153.

Goggi A S， Lopez-Sanchez H， Caragea P， et al. Gene flow in maize fields with different local pollen densities[J]. International Journal of Biometeorology， 2007， 51（6）： 493-503.

Hu N， Hu J C， Jiang X D， et al. Establishment and optimization of a regionally applicable maize gene-flow model[J]. Transgenic Research， 2014， 23（5）： 795-807.

Weber D F. Use of maize monosomics for gene localization and dosage studies[M]//Freeling M， Walbot V. The Maize handbook. New York： Springer-Verlag， 1994.

Nascimento V E， de Resende Von Pinho V E， Von Pinho R G， et al. Gene flow on insectresistant genetically modified maize[J]. Pesquisa Agropecuária Brasileira， 2012， 47（6）： 784-790.

王志兴， 王旭静， 贾士荣. 主要农作物转基因飘流频率和距离的数据调研与分析Ⅰ.背景、调研目的及所考虑的问题[J]. 中国农业科技导报， 2011， 13（3）： 26-29.

Ricci B， Messéan A， Lelièvre A.， et al. Improving the management of coexistence between GM and non-GM maize with a spatially explicit model of cross-pollination[J]. European Journal of Agronomy， 2016， 77： 90-100.

Devos Y， Reheul D， De Schrijver A. The co-existence between transgenic and non-transgenic maize in the European Union： a focus on pollen flow and cross-fertilization[J]. Environmental Biosafety Research， 2005， 4（2）： 71-87..

卢宗志， 江晓东， 张  明， 等. 玉米花粉扩散频率及距离研究[J]. 玉米科学， 2012， 20（2）： 149-152.

郭彩玉， 赵念文， 赵字峰. 玉米花粉研究初报[J]. 东北师范大学学报（自然科学版）， 1987（4）： 81-84.

Wang L， Haccou P， Lu B R. High-resolution gene flow model for assessing environmental impacts of transgene escape based on biological parameters and wind speed[J]. PLoS One， 2016， 11（3）： e0149563.