高效液相色谱法测定口腔清洁用品中11种防腐剂含量

吴智慧，杨 铭

(浙江方圆检测集团股份有限公司，浙江 杭州 310018)

口腔清洁用品是常见的日用消费品，主要包括牙膏、漱口水、牙粉等。口腔清洁用品中添加的防腐剂主要用于抑制微生物的生长，保证产品在使用周期的质量安全。由于口腔清洁产品直接作用于口腔，其中防腐剂的种类和含量决定了其对人身健康的影响，因此亟需对口腔清洁用品中防腐剂含量开展检测研究。

口腔清洁用品中添加的防腐剂有：酸性防腐剂(包括苯甲酸、山梨酸和丙酸以及它们的盐类等)，酯类防腐剂(包括对羟基苯甲酸酯类(尼泊金酯类)、没食子酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯等)，新型合成防腐剂(α-(2-羟基乙胺)-β-苯甲酰丙酸乙酯盐酸盐)，新型天然防腐剂(溶菌酶，中草药类，介子提取物等)。新型防腐剂目前尚未普及使用，传统防腐剂仍是市场主流，因此本文重点研究11种常见的口腔清洁用品传统防腐剂。

目前防腐剂的检测方法主要有气相色谱法(GC)、分光光度法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等。气相色谱法选择性高，可分离性能相近物质和多组分混合物，分析速度快，但是不能直接定性；分光光度法使用过程中几乎不损耗仪器，节约成本，灵敏度高，但是专属性不强，受外界的影响大，误差相对较大；薄层色谱法检测设备简单，操作方便，但是重复性不好；高效液相色谱法，灵敏度高可测定痕量物质，准确性好，分辨率高于其他色谱法，可通过光谱图对比定性，是目前比较好的防腐剂检测方法。国内已有部分关于口腔清洁用品中个别防腐剂种类检测的报道[1-2]，但是罕见对口腔清洁用品中多种防腐剂检测方法的研究。按照口腔用品的现状及未来发展趋势，单一防腐剂体系将逐渐被几种防腐剂复配形成广谱高效的协同增效防腐体系所取代[3]。因此本文选择采用高效液相色谱法对口腔清洁用品中的11种常见防腐剂的检测技术进行研究。通过对样品前处理及仪器分析条件的优化，建立一条高效、简便、环保、准确度高的口腔清洁用品中防腐剂含量的测定方法。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

仪器：安捷伦-1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；KQ-100DB超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；xs204电子天平，梅特勒托利多有限公司；SHZ-Ⅲ真空抽滤装置，上海亚荣生化仪器厂；FE28型pH计，梅特勒托利多有限公司；Milli-Q纯水仪，Millipore公司。

试剂：甲醇、乙腈、磷酸、氢氟酸、氢氧化钠，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钠、氯化十六烷三甲胺，优级纯，无锡市展望化工试剂有限公司；甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮、苯甲酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸乙酯，标准品，Dr.Ehrenstorfer；没食子酸(标准品)，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：ACE Excel C185微米 250×4.6 mm i.d.；流动相：甲醇+乙腈+磷酸二氢钠=35+15+50(v/v/v)；流速1.5 mL/min；波长：甲基氯异噻唑啉酮，没食子酸和甲基异噻唑啉酮在280 nm 检测；其他组分在254 nm处检测；柱温：25 ℃；进样量：5.0微升。

1.3 样品前处理

称1.0 g样品于25.0 mL比色管中，用50%甲醇的水溶液稀释至刻度，在30 ℃水浴情况下超声振荡30 min，取上清液用0.45微米微孔过滤，滤液供测定用。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

在不同检测波长下，各种类防腐剂的紫外吸收程度不同。将11种防腐剂分别进样分析，得到各防腐剂的紫外吸收光谱图，观察比较后可得，在波长254 nm处大部分防腐剂均有较强吸收，在波长280 nm处没食子酸、甲基异噻唑啉酮和甲基氯异噻唑啉酮均有较强吸收。因此选择254 nm以及280 nm为最佳的检测波长。

2.2 流动相选择

2.2.1 流动相配比

高效液相色谱法同时测定化妆品中多种防腐剂已有多篇文献报道，大多选择甲醇+乙腈+磷酸二氢钠作为流动相。本实验为得到较好的分离度以及较快的分析时间，尝试了不同的流动相配比。

表1 流动相配比Table 1 Flow matching ratio

结果表明，流动相配比采用方法2时，虽然峰分离程度好，但是出峰整体时间变长。流动相配比使用方法3时，色谱峰存在重叠现象，不能完全分离。在使用方法4，色谱峰未能全部显示。而流动相采用方法5，峰型杂乱，分离度差，无法有效分离。采用了方法1：甲醇+乙腈+磷酸二氢钠=35+15+50(v/v/v)作流动相时，色谱峰完全基线分离，且峰型良好，得到最佳分离效果。

2.2.2 流动相pH

11种防腐剂中含有酸性基团，为抑制解离，流动相应为酸性。综合考虑ACE Excel 5 C18色谱柱的最佳使用条件，流动相调试范围采用3.5≤pH<7。

磷酸二氢钠溶液配制成pH=3.5，pH=4，pH=4.5三种。pH=4.5时，pH对出峰情况有显著影响，无法正常识别。pH=4时没食子酸和甲基氯异唑啉酮两者的色谱峰保留时间相接近，分离度差，无法有效分离。因此pH选择3.5。

2.3 柱温选择

初始柱温升高的同时理论塔板数呈线性下降。进样口温度和初始柱温温差越大，待测物越容易冷凝在色谱柱头，其初始色谱带沿柱轴方向展开越小分离能力越强[4]。但是在实际应用中要综合考虑分析时间是否适中，色谱峰是否分离良好。本实验观察分离效果发现，柱温对分离效果的影响并不显著，当色谱柱柱温为25 ℃时分离效果最为显著。因此选择25 ℃为最优色谱柱柱温。

2.4 仪器参数优化后11种防腐剂的标准谱图

当采用ACE Excel C185 μm, 250×4.6 mm色谱柱、甲醇+乙腈+磷酸二氢钠=35+15+50(v/v/v)、流速 1.5 mL/min、柱温25 ℃的仪器参数时，能实现11种防腐剂色谱峰峰形良好，分离完全。在最优色谱条件下，得到11种防腐剂的标准谱图如图1所示。

图1 采用方法1流动相配比得到的11种防腐剂的标准谱图Fig.1 Standard spectrograms of 11 preservatives obtained by flow matching method 1

2.5 防腐剂提取条件优化

2.5.1 提取剂的选择

市场所售牙膏中，主要摩擦剂为水合硅石(二氧化硅)，少部分含有碳酸钙和磷酸氢钙[5]。拟采取破坏主体摩擦剂，提取样品的目的，在相同提取条件下各采用4种溶剂提取，见表2、表3。

水合硅石类提取剂：纯水，甲醇，50%甲醇水溶液，5%氢氟酸50%甲醇水溶液。碳酸钙类提取剂：纯水，甲醇，50%甲醇水溶液，5%磷酸50%甲醇水溶液。磷酸氢钙类提取剂：纯水，甲醇，50%甲醇水溶液，5%氢氧化钠50%甲醇水溶液。

表2 水合硅石类口腔清洁用品中防腐剂的提取条件Table 2 Extraction conditions of preservatives in hydrated silica oral cleaning products

表3 不同提取条件下各目标物质的提取效果 Table 3 Extraction effect of each target substance under different extraction conditions (%)

以水合硅石基质为例，通过实验结果发现，提取剂为纯水时，加标样品中防腐剂未能得到充分提取。提取剂为甲醇时，由于样品溶解部分过少，出峰情况不乐观。当目的是破坏主体摩擦剂时，由于过强的酸碱性会损坏仪器，故选用的提取剂所添加酸碱浓度较低。此时操作成本上升且不能达到较好的提取效果。重复上述步骤进行碳酸钙类基质和磷酸氢钙类基质提取剂的测定，均符合上述规律。综上，选择50%甲醇水溶液为本次实验提取剂。

2.5.2 超声时间

以50%甲醇的水溶液为提取溶剂，1.0 g加标样品在25 ℃下超声提取10、20、30、40、50 min后，过0.45 μm混合膜，上机分析。通过实验数据发现，在前30 min内提取效果随着时间增加而显著提高，30 min后，提取效果变化不显著。

2.5.3 超声温度

50%甲醇的水溶液为提取溶剂，1.0 g加标样品在20、25、30、40、50 ℃下超声提取30 min后，过0.45 μm混合膜，上机分析。30 ℃时各特征峰峰型良好，分离完全。因此选用30 ℃为最佳超声提取温度。

2.6 标准曲线和检出限

表4 11种防腐剂的检出限、线性回归方程和相关系数表Table 4 Detection limit, linear regression equation and correlation coefficient of 11 preservatives

将配制好的5，10，20，50，100，200 μg/L的标准工作溶液，在最优的色谱条件下进行高效液相色谱分析，得到11种防腐剂的标准曲线。再分别以3倍信噪比(S/N=3)来计算检出限。结果表明，11种目标物质在5～200 μg/L 范围内线性良好，各相关系数在0.999以上，见表4。

2.7 方法精密度和加标回收实验

在空白样品中添加标准混合溶液进行方法的精密度和回收率测定实验，试验通过往空白样品中添加混合标准溶液，以3个浓度水平1、10、20 mg/L，按照色谱条件进行试验，每个浓度进行6次重复进样，测出平均回收率和相对标准偏差(RSD，n=6)，见表5。由表5可知，11种防腐剂的加标回收率在91.81%～101.70%之间，RSD在0.08%～3.3%之间。

表5 空白样品的加标回收率和精密度表Table 5 Standard addition recovery and precision of blank sample

2.8 样品分析

按试验方法对从市场上随机采购的不同品牌的10批次口腔清洁用品，包括6批次牙膏，2批次牙粉，2 批次漱口水，试验结果表明，有1批次牙粉中检出苯甲醇，含量为355.4 μg/g，其

外包装上也标明含有苯甲醇。其余9批次产品中此11种防腐剂未检出。

3 结 论

本文研究了不同的流动相配比及提取剂选择，并对高效液相色谱仪测定参数进行了优化，得到的优化方法是：样品采用50%甲醇超声提取，色谱柱ACE Excel C185微米 250×4.6 mm、甲醇+乙腈+磷酸二氢钠=35+15+50(v/v/v)、流速1.5 mL/min、柱温25 ℃，254 nm以及280 nm测定波长，流动相pH 3.5，超声温度30 ℃，时间30 min。本方法操作简单，成本低，可应用于口腔清洁产品中11种防腐剂同时测定，填补口腔清洁产品领域多种防腐剂检测的空白，也为政府部门的监管提供技术支持。