外泌体的生物特性及其在肺动脉高压中应用的研究进展

李凯泽 陈建英

(广东医科大学附属医院心内科，湛江市 524000，电子邮箱：370597780@qq.com)

【提要】 肺动脉高压是一种难治的、严重的并呈进行性发展的心肺疾病，其表现为肺血管重构、免疫炎症失调和线粒体代谢功能紊乱等一系列问题，并可能涉及微小RNA的改变，可导致右心室后负荷加重，进而引起右心衰竭，最终导致死亡。大部分药物对肺动脉高压的治疗效果并不理想，多数患者预后差。外泌体是一种信号交流介质，在肺组织细胞间的信号交流中有着不可或缺的作用。越来越多的证据表明外泌体能改善免疫炎症水平、调节线粒体代谢功能及抑制肺血管重构，从而改善肺动脉高压。本文就外泌体的生物特性及其在肺动脉高压中应用的研究进展进行综述。

肺动脉高压是由肺血管重构导致的罕见的慢性发展的严重心肺疾病，可导致右心衰竭和死亡。其主要病理特征包含肺动脉平滑肌和内皮细胞的增殖及抗凋亡，细胞外基质的产生和沉积，促炎细胞因子和趋化细胞因子的聚集以及白细胞在肺血管周围区域的浸润[1]。肺动脉高压定义为静息状态下平均肺动脉压25 mmHg或以上，或运动状态下平均肺动脉压30 mmHg或以上[2]。据统计，全球每年有4万余人患肺动脉高压，且病死率高达15%[3]。肺动脉高压患者即使经过正规治疗，3年存活率也仅为55%～65%，目前市面上的药物对肺动脉高压的疗效并不十分理想，大多数患者预后并不好，生活质量改善不明显，并且药物费用昂贵，常伴有明显的副作用[4]。因此，临床上急需一种新的能够治愈或控制肺动脉高压发展的药物。研究表明外泌体能改善肺动脉高压[5]，外泌体的出现给肺动脉高压患者带来了曙光。本文就外泌体的生物特性及其在肺动脉高压中应用的研究进展进行综述。

1 外泌体的生物特性

外泌体是30～100 nm的单膜小囊泡，具有双分子磷脂结构。外泌体包含41 860种蛋白质，超过7 540种RNA和1 116种脂质分子，还包含特定的糖缀合物以及与膜相关的高级寡聚蛋白复合物[6]。外泌体在不同生物状态下及其形成阶段中，形态、大小甚至所含内容物都会有所不同。一般来说，外泌体的内容物会因其不同来源而不同。此外，外泌体携带重要的通信息分子，如脂筏(鞘脂和胆固醇)、蛋白质(四跨膜蛋白、黏附分子和其他一些成分)以及一些遗传成分(包括DNA和非编码的RNA)，在细胞之间的信号通信中有着不可替代的作用[7]。

1.1 外泌体来源与形成 细胞膜内部出芽，形成早期内体；早期内体在高尔基体内作用，产生晚期内体；晚期内体膜内陷，混杂高尔基体和细胞核的蛋白质，形成腔内囊泡[8]；腔内囊泡与溶酶体融合或与细胞膜融合后降解，再从细胞膜分泌出来，形成细胞外囊泡。根据粒径及细胞内来源不同，细胞外囊泡可分三类：微泡(50 nm～1 μm)，外泌体(30～150 nm)和凋亡小体(50 nm～5 μm)[9]。外泌体不只是在哺乳动物细胞分泌，原生生物、真菌和植物同样也可分泌外泌体[10]。几乎所有哺乳动物的细胞都会产生外泌体，包括心肌细胞、内皮细胞、心脏成纤维细胞、干细胞等[11]。

1.2 外泌体提取和鉴定 伴随生物医学产业的高速发展，外泌体作为新型的生物材料，具有极其重要的研究价值，因此需要分离提纯。目前常用的分离技术包括超高速离心技术、基于尺寸的分离技术、聚合物沉淀技术、免疫亲和捕获技术以及微流体衍生芯片分离技术[11]。前三者是最常使用的外泌体分离技术[12]，而超高速离心技术又是使用最广泛的分离技术。但是最有发展前景的分离技术为微流体衍生芯片分离技术，该技术能在微观尺度下把控外泌体的生物化学及物理特征的差别，如密度、大小和免疫亲和力[13]。Tauro等[14]采用超高速离心技术、密度梯度分离和免疫亲和捕获技术分离人类结肠癌细胞系LIM1863衍生的外泌体 ，结果表明免疫亲和捕获技术分离出来的外泌体结构更完整。Gheinani等[15]对超高速离心技术和尺寸排阻色谱方法进行改良后，每次分离的外泌体大小都在50～150 nm之间。外泌体组分复杂，提取分离技术繁杂，因此有必要对外泌体进行鉴定。迄今为止，外泌体的鉴定技术有以下几种：蛋白质印迹、胰蛋白酶消化、流式细胞术、质谱和酶联免疫吸附测定分析[16]。Chen等[17]认为鉴定外泌体时，先用动态光散射技术分析外泌体大小，再用透射电子显微镜观察外泌体形态，最后用蛋白质印迹法检测外泌体成分。

1.3 外泌体的潜能 外泌体可直接作用于靶点，对疾病进行干预。Wang等[18]发现在人骨髓间充质干细胞中提取的外泌体，过表达微小RNA(microRNA，miRNA)-34a可介导MYCN基因表达下调，从而延缓胶质母细胞瘤的疾病进展。外泌体可作为载体运输药物，对疾病进行治疗。幼稚巨噬细胞衍生的外泌体可以穿过血脑屏障，将脑源性神经营养因子的载体蛋白运输至脑，从而治疗脑炎[19]。此外，外泌体还可以作为疾病诊断及判断预后的标志物。研究表明，外泌体来源的胎儿循环DNA有可能成为判断妊娠并发症预后的生物标志物，并有可能解释各种妊娠并发症的发病机制[20]。而尿外泌体miRNA-30c-5p可靶向调控热休克蛋白A5的表达来阻止肾透明细胞癌的发展，且miRNA-30c-5p能够稳定扩增并在肾透明细胞癌中有表达特异性，可成为早期肾透明细胞癌潜在的诊断生物标志物[21]。

2 外泌体和肺动脉高压

2.1 外泌体对肺动脉高压线粒体的影响 线粒体是细胞进行氧化代谢的主要场所，是营养物质最终氧化释放能量的场所，线粒体正常工作时会出现膜电位。在发生缺氧性肺动脉高压时，线粒体功能障碍可促进内皮损伤，并导致膜电位增加[22]。在缺氧诱导肺动脉高压大鼠模型中，线粒体功能障碍并导致膜电位增加，进而调节线粒体Ca2+内流，从而影响血管平滑肌细胞增殖[23]。上述研究表明发生肺动脉高压时存在线粒体功能障碍。线粒体产生三磷酸腺苷的过程中会产生副产物氧自由基，虽然线粒体存在抗氧化剂，但是过量的氧自由基依然会对线粒体蛋白质、线粒体DNA及线粒体膜造成损害[24]，导致线粒体产生三磷酸腺苷及活性氧的效率降低。活性氧的减少，可抑制细胞氧化还原状态，导致细胞出现一个伪缺氧环境，引起缺氧诱导因子1常氧活化[25]，从而下调丙酮酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶1的表达[26]。而外泌体可通过抑制上游抑制剂Sirtuin 4的表达，上调丙酮酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶1的表达，从而改善肺动脉高压的线粒体功能[27]。上述研究表明外泌体可通过恢复线粒体功能，改善肺动脉高压。

2.2 外泌体对肺动脉高压免疫炎症的影响 炎症细胞可导致血管内皮细胞凋亡和血管平滑肌增殖，免疫细胞募集，产生正反馈效应，引起血管重构，促进肺动脉高压发展[28-29]。在特发性肺动脉患者中，免疫炎症因子如白细胞介素(interleukin， IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子α和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)水平明显升高，预示其病情预后不良，导致死亡率升高[30]。与正常健康小鼠对比，在缺氧诱导的肺动脉高压小鼠模型中，MCP-1水平显著增加，并与巨噬细胞极化和肺血管重构密切相关[31]。IL-6水平在肺动脉高压患者中明显升高，并激活信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，促进外周细胞迁移及血管重构[32]。巨噬细胞参与肺动脉高压的发病，并分泌天冬酰胺内肽酶，激活基质金属蛋白酶2和转化生长因子β1的信号传导通路，从而促进疾病发展[33]。而在低氧性诱导的肺动脉高压小鼠模型中，外泌体能抑制STAT3通路，降低IL-6、MCP-1水平，减少巨噬细胞聚集，从而改善肺动脉高压[34]。外泌体通过let-7b上调抗炎因子水平及促进M2巨噬细胞活化，从而调节巨噬细胞功能[35]。间充质干细胞来源的外泌体通过调节巨噬细胞表型，改善肺功能，减少肺纤维化和肺动脉重构，从而改善肺动脉高压[36]。以上研究表明外泌体可通过调节免疫炎症因子水平，改善肺动脉高压。

2.3 外泌体对肺动脉高压miRNA的影响 肺动脉高压是一种进行性破坏的严重疾病，尽管学者们不断开发新的疗法，但是临床获益有限，因此迫切需要阐明肺动脉高压的发病机制。据报道，肺动脉高压的发病机制涉及miRNA失调，修正miRNA失调能逆转肺动脉高压[37]。重度肺动脉高压患者的血管中miRNA-204表达减少；血管紧张素Ⅱ和内皮素-1可以下调miRNA-204表达水平，激活STAT3通路，促进肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡抵抗，引起血管重构[38]。外泌体可改善肺动脉平滑肌细胞增殖和细胞凋亡抗性[39]，从而改善肺动脉血管重构。Aliotta等[40]发现从野百合碱诱导的肺动脉高压小鼠的血浆或肺中分离的外泌体，可以诱导健康小鼠中右心室/左心室+室间隔比率增加，而从骨髓干细胞分离的外泌体可以预防和逆转野百合碱诱导的肺动脉高压，因而可逆转右心室肥大和肺血管重构。表明外泌体在肺动脉高压小鼠模型中对调节肺高血压反应起关键作用。间充质基质细胞衍生的外泌体可抑制STAT3的激活，上调肺组织内的miRNA-204水平，对肺发挥多效保护作用，从而抑制肺动脉高压的发展[34]。间充质干细胞衍生的外泌体可通过抑制肌球蛋白1e将miRNA-125b转移至血管平滑肌细胞，从而逆转肺动脉血管重构[41]。这些研究表明外泌体可通过调节miRNA水平，逆转肺动脉血管重构，进而改善肺动脉高压。

2.4 外泌体对肺动脉高压相关基因的影响 发生肺动脉高压最常见的遗传原因是编码骨形态发生蛋白受体2(bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)基因发生突变。一项纳入1550名肺动脉高压患者的研究中，发生BMPR2突变的患者有448名(29%)，并且突变携带者年龄较小，肺动脉压力及肺动脉阻力较大但心脏指数低；与非突变携带者相比，突变携带者在年轻时易出现更严重的疾病及更高的死亡风险[42]。BMPR2表达的减低或功能的失调，将会介导高迁移率蛋白家族A1表达增加，导致肺动脉内皮细胞发生内皮-间质转化，促进特发性肺动脉高压特征性的闭塞性重构[43]。与非BMPR2突变携带者相比，从BMPR2突变携带者中可分离出更多由血液生长内皮细胞释放出的外泌体，而对比微泡，这种来源的外泌体含有更多翻译调控肿瘤蛋白，而调控肿瘤蛋白是一种能促存活和抗细胞凋亡的物质，并参与肺动脉高压的肺血管细胞增殖及抗凋亡，外泌体中的翻译调节肿瘤蛋白有望成为肺动脉高压的潜在诊断标志物[44]。脂肪间充质干细胞来源的外泌体中的miRNA-191可调控BMPR2表达水平，进而在肺动脉高压中发挥治疗作用[45]。由上可见，外泌体不仅可通过miRNA-191来调控BMPR2的表达水平，对BMPR2相关性的肺动脉高压起保护作用，还有望成为BMPR2相关性肺动脉高压的潜在诊断标志物。

3 展 望

越来越多的证据表明外泌体是细胞之间的通讯器，其可将信号传递到远处靶点，发挥治疗疾病或预测疾病进展的功能。与干细胞不同，外泌体具有较高的生物相容性。此外，外泌体具有抗性膜，具有较长的自我生存期，利于长期储存，这是外泌体运用于临床治疗肺动脉高压的一个有利条件。外泌体可为治疗或干预肺动脉高压提供新思路。然而，目前外泌体在肺动脉高压中的应用尚处于初期阶段，分离纯化、生物异质性以及自身大小等都是亟待解决的问题，全面了解外泌体的功能和作用机制，仍然是临床上的巨大挑战。