振腹法治疗寒凝证类原发性痛经模型大鼠优效参数组合的探讨

邵帅 于天源 耿楠 魏槃 刘迪 吕桃桃

原发性痛经是女性的高发疾病，其中寒凝证痛经是最主要的证型[1]。寒凝型痛经以经行或经前小腹冷痛，得热痛减，经量少为主要临床表现，其病机为阴寒内凝，血行不畅，不通则痛。振腹疗法能够温阳散寒、缓急止痛，对治疗寒凝证痛经疗效确切，但不同的振动频率、幅度和时间都会影响振腹疗法的疗效。因此，参数研究是保证振腹临床疗效的关键课题。目前关于振法的参数研究主要着眼于振动轨迹和频率[2-3]，针对振法幅度和时间的研究尚显不足。因此，本实验从振腹的频率、幅度和时间三个参数展开研究，采用正交设计[4]，精简实验参数组别，最终得出振腹疗效的最优参数。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

使用性成熟、未交配SPF级3月龄雌性SD大鼠66只，体重(220±10)g。由北京维通利华生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK2017-10(京)。按照随机数字法，分为盐水组、寒凝证痛经模型组(简称模型组)和9个振腹组(振腹一组～振腹九组)，每组各6只。饲养条件：屏障环境，室内温度(23±1)℃，湿度(40±5)%，日光灯光照，普通清洁级动物饲料，自由饮用自来水。所有实验程序均符合动物福利与伦理原则，并经北京中医药大学动物使用和管理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂

P640型红外热成像仪(美国FLIR公司)，BC/BD-379HB卧式冰柜(青岛海尔集团)，TX51显微镜(日本OlymPus公司)，BT223S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，5810R型高速冷冻离心机(德国EPPendorf公司)，MDF-u50A型超低温冰箱(日本三洋公司)，全自动放免计数仪(西安核仪器厂)，推拿振法模拟仪(发明专利号：ZL 2016 2 0025264.7)。

苯甲酸雌二醇注射液(宁波市三生药业有限公司，批号120207)，缩宫素注射液(上海禾丰制药厂，批号：120302)，戊巴比妥钠(批号：T20080530)，美蓝染色溶液(自制)。

1.3 造模方法

雌性SD大鼠适应性喂养1周后，每日早8点用细棉签蘸取少量生理盐水后缓慢插进大鼠阴道约0.5 cm，并于轻揉地旋转后取出，把粘附阴道内含物的细棉签在载玻片上薄而均匀旋转涂开，自然风干，用95%酒精固定3～5分钟，用蒸馏水沿玻片的一端冲洗2～3分钟后自然干燥，美蓝染色5分钟，蒸馏水冲洗后烘干固定。最后在显微镜下观察阴道涂片的细胞学变化，观察10天。选择动情间期(白细胞占极大范围的视野，细胞形态较小，偶见极少量的有核上皮细胞和角化上皮细胞)大鼠造模。其余大鼠继续观察直至动情间期再进行实验。具体见图1。

采用全身冷冻法结合苯甲酸雌二醇、缩宫素注射法造模[4-5]。(1)冷冻：第1～5天，将模型组和9个振腹组大鼠放入-25℃冰柜，冷冻2小时后，打开冰柜换气10秒钟，再冷冻2小时，将大鼠取出；(2)致敏：第1～10天，每日给予大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇，以提高子宫对致痛物的敏感度。第1天及第10天注射剂量：0.5 mg/只，第2～9天注射剂量：0.2 mg/只；(3)致痛：第10天注射苯甲酸雌二醇后1小时，腹腔注射缩宫素2 U/只，致大鼠疼痛。盐水组每日以相同方法给予与模型组注射药物等量的生理盐水。

图1 大鼠造模及干预时间安排

1.4 干预方法

盐水组、模型组常规喂养。振腹组(一～九组)从致敏第6天开始治疗，每日早8点治疗1次，连续治疗5天。治疗时将大鼠四肢固定于鼠板上并暴露腹部。将“推拿振法模拟仪”直径5 mm圆形光滑按摩头置于大鼠腹部关元穴，并进行振腹治疗。振腹治疗参数根据“三因素三水平”正交实验设计如下：即A、B、C三个因素(分别代表时间、频率、振幅)及1、2、3三个水平(分别代表低、中、高)，根据正交实验设计分为9组，每组具体振腹参数见表1。每组根据设定参数进行定量治疗。

表1 三因素三水平振腹参数设计表

1.5 行为学指标检测

1.5.1 扭体潜伏期 大鼠腹部疼痛时，会出现身体侧向旋转、腹部收缩的现象，称为扭体反应。通过观察大鼠是否出现扭体反应，可判断大鼠是否出现痛经。大鼠致痛后至第1次发生扭体反应的时间为大鼠的扭体潜伏期。大鼠注射缩宫素(致痛)后，立刻将大鼠放回鼠笼，同时用秒表开始计时，直至大鼠发生第1次扭体反应，记录时间。

1.5.2 扭体评分 大鼠致痛1小时后，同时记录各组大鼠20分钟内发生扭体反应的次数和等级。本实验采用Schmauss等[6]提出的行为学评分标准，将各组大鼠扭体行为分为0～3级四个等级，分别记0～3分。0级：正常姿势(手爪平放盒底或正常探查行为)；1级：身体斜向一边；2级：后肢伸展，后爪背屈，躯体伸展伴盆骨频繁侧向旋转；3级：腹部肌肉收缩，后肢后伸。观察时间内的总分计为扭体评分。

1.5.3 子宫体表投影温度 寒凝证原发性痛经大鼠会出现子宫体表投影温度降低[7]。通过观察大鼠子宫体表投影温度，能够判断大鼠寒凝证的轻重程度，温度越低，寒凝证越严重。扭体反应观察结束后，将大鼠固定在与红外热成像仪摄像头的距离为1 m透明鼠板上，并将大鼠子宫体表投影区剃毛。大鼠致痛1.5小时后，在室温(23±1)℃，湿度(60±5)%的条件下，使用红外热成像仪检测各组大鼠子宫体表投影区温度并记录3次，取平均值作为该大鼠的子宫体表投影温度。

1.6 统计学方法

1.6.2 正交实验计数 计算9个振腹组各项指标的平均值并建立正交分析表。K值为所在因素三水平所对应的实验指标和的平均值，R值为所在因素K值的极差。K值越大，该参数对该指标的疗效越好。R值越大，则该因素对该指标的影响越大。通过计算K值和R值可直接判断三因素的主次关系。以及该指标下的最优参数。将9个振腹组各项指标，根据无空白列有重复正交实验进行方差分析。P<0.05 为存在统计学意义。F值越大，则该因素对实验结果的影响越大。综合正交分析表和方差分析表，确定三因素的主次关系，并确定最优参数。

表2 各组寒凝证类原发性痛经模型大鼠行为学指标结果比较

注： 与盐水组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.05，cP<0.01。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学比较

除盐水组的扭体潜伏期和扭体评分外，各组各项数据均呈正态分布且方差齐。盐水组大鼠均未出现扭体反应，模型组和9个振腹组大鼠均出现扭体反应。与盐水组比较，模型组大鼠子宫体表投影温度显著下降(P<0.01)，表明模型制备成功。与模型组比较，振腹二、三、八、九组大鼠扭体潜伏期明显延长(P<0.05)，除振腹五组外，其余振腹组大鼠扭体评分均显著降低(P<0.05)，所有振腹组大鼠子宫体表投影温度均增高(P<0.05)。各组大鼠各项行为学指标结果见表2。

2.2 不同参数对大鼠潜伏期的影响

A、B、C三因素对痛经大鼠潜伏期均存在较大影响 (P<0.05)。其中A和B的影响更大(P<0.01)。根据痛经潜伏期R值和F值大小可知，三因素的主次关系为A>B>C。且由K值可知，痛经发作潜伏期的最优参数组合为A3B3C2。振腹组大鼠行为学的正交分析结果见表3。

根据扭体反应R值和F值大小可知，对大鼠扭体影响最大的参数是A(P<0.01)，其次是B(P<0.01)，而大鼠扭体反应与C之间并无明显关系(P>0.05)。说明三因素的主次关系为A>B>C。且由K值可知，扭体评分的最优参数组合为A3B3C1。

表3 不同参数对痛经大鼠行为学正交分析表

对痛经大鼠子宫体表投影温度影响最大的参数是A(P<0.01)，其次是C(P<0.05)，而子宫温度与B之间并无明显关系(P>0.05)，说明三因素的主次关系为A>C>B。且由K值可知，子宫体表投影温度的最优参数组合为A3C1B1。振腹组大鼠行为学的多因素方差分析结果见表4。

2.3 综合三种标准下的主因素及优效参数组合

由表3～4结果表明，振腹治疗寒凝痛经大鼠最重要的参数为治疗时间。振动时间、频率、幅度三种因素的重要程度及其最优参数排序如下：痛经发作潜伏期为A3B3C2，扭体评分为A3B3C1，子宫体表投影温度为A3C1B1。综合考虑，振腹治疗寒凝痛经大鼠的优效参数组合为A3B3C1，即长时间、高频率、低幅度。

表4 不同参数对痛经大鼠行为学影响的多因素方差分析表

3 讨论

振腹疗法是中医推拿的重要组成部分，能够治疗脏腑疾病，具有温阳散寒、缓急止痛的作用[8]。行经前在关元穴处施用振腹疗法[9-10]，能够治疗寒凝血瘀证痛经。近年来，科研人员开始运用新型测试手段对振法的相关参数进行研究，并且有了初步的认识和探讨[11-12]。本实验前期对振腹的手法参数进行了初步生物力学研究[2]，然而振腹参数与疗效关系的研究仍未形成明确结论。本研究以寒凝痛经模型大鼠为研究对象，设定振动时间、频率、幅度三个因素及高、中、低三个水平，应用“推拿振法模拟仪”确保干预参数稳定可控，采用正交设计精简实验组别，以探究振腹治疗寒凝痛经的最优参数组合。

振腹疗法能够通过调节痛经相关蛋白的表达以治疗原发性痛经。张巧娜[13]发现振腹疗法可以提高原发性痛经大鼠血清和子宫前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)表达，降低前列腺素F2(prostaglandin, PGF2)表达，抑制PGF受体在子宫内膜上的表达，以缓解子宫平滑肌收缩，改善痛经症状。周金山等[14]将辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)注入大鼠关元穴区，通过神经束路追踪技术研究一级感觉神经元在脊神经节的阶段分布。结果显示，关元穴和子宫组织的传入投影在腰3至骶5之间的脊神经节内汇聚重叠。这可能是子宫与关元穴联系的解剖学基础。

振腹疗法可以解痉、温经、止痛。本实验采用注射致痛剂后第1次出现扭体反应的时间评价大鼠疼痛的潜伏期，采用扭体反应评价大鼠疼痛程度，采用红外热像仪动态监测各组大鼠子宫体表投影区温度。根据本实验结果，振腹干预可以明显降低痛经模型大鼠的扭体评分，延长扭体反应的潜伏期，提高子宫体表投影的温度，说明振腹疗法可以缓解缩宫素诱导的痛经大鼠子宫肌的剧烈收缩，抑制子宫平滑肌痉挛，起到解痉止痛的作用，并且能够促进子宫局部血液循环，达到温经止痛的目的。

振腹疗法最主要的影响参数是治疗时间，长时间、高频、低幅的振动是振腹治疗寒凝证类痛经的综合优效参数组合。本实验结果显示，治疗时间越长，振腹疗法对潜伏期的延长、疼痛的缓解、子宫血液循环的改善就越好。而振腹频率与振腹幅度相比，振腹频率对疼痛的缓解作用更大，而振腹幅度在提高子宫温度方面影响更大。但二者都对延长潜伏期有着重要作用。考虑到每个影响因素在治疗中发挥作用程度不同，根据影响因素的主次程度，选出振腹治疗寒凝痛经大鼠的综合优效参数组合，即长时间、高频、低幅的振动。因此临床振腹治疗寒凝证原发性痛经时，可以通过延长治疗时间，加快振动频率，降低振动幅度以提高疗效。

本实验设计尚有不足之处。根据正交分析，选取了9个振腹参数组合，并得出了综合优效参数，但该最优参数组合并未出现在9个振腹组中。另外，实验仅从行为学角度选出了振腹治疗的最优参数，而关于影响痛经发生最重要的蛋白，如前列腺素等的表达水平却尚未涉及。因此，下一步试验应继续从行为学、形态学、分子生物学角度，评判最优参数组合的疗效。

综上所述，振腹疗法能够通过延长寒凝证原发性痛经大鼠的痛经发作潜伏期，减轻疼痛，提高子宫温度，以改善大鼠痛经症状。振动时间、频率、幅度是影响振腹法治疗寒凝证痛经的关键因素，其中时间是最主要的影响因素。长时间、高频、低幅的振动是振腹治疗寒凝证类痛经的综合优效参数组合。