中药复方筋脉通对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠肝脏损伤和脂肪变性的保护作用

孙青 薛晓伟 闫斌 田国庆 梁晓春

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，其疾病谱包括非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝细胞癌[1-2]。近年来，胰岛素抵抗和肥胖在1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)发病机制中的作用受到关注[3]。临床研究发现成人T1DM患者NAFLD发病风险增加[4-5]；研究证实链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导T1DM大鼠可见肝脏脂肪变性[6-7]，其具体机制尚不清楚，缺乏有效治疗方法。本研究拟初步探索中药复方筋脉通对STZ诱导糖尿病大鼠肝脏损伤和脂肪变性等表型的保护作用，为进一步机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

6～8周龄雄性SD大鼠，体重180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2011-0004。于北京协和医院动物实验室SPF级环境饲养，维持饲料喂养，进食、饮水不限。筋脉通胶囊为中国医学科学院北京协和医院院内制剂，由菟丝子10 g、女贞子10 g、水蛭3 g、延胡索10 g、桂枝10 g、细辛3 g等组成，每粒含生药0.35 g，由北京九龙制药厂加工生产(批号120119)。STZ购自美国Sigma-Aldrich公司；血糖仪购自美国Abbott公司；苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)液购自北京九州柏林生物科技有限公司；Masson三色染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.2 动物分组及给药

SD大鼠适应性喂养3天，随机分正常对照组和糖尿病组和筋脉通组，每组各8只。造模前禁食过夜，正常对照组注射等量的枸橼酸盐缓冲液，糖尿病组和筋脉通组一次性腹腔注射1%STZ 55 mg/kg(0.1 mmol/L枸橼酸盐缓冲液配制，pH 4.5)。72小时后用血糖仪测定尾尖血糖，正常对照组大鼠血糖<7.0 mmol/L，糖尿病组和筋脉通组大鼠血糖≥16.7 mmol/L为造模成功，筋脉通组按成人剂量10倍(0.876 g·kg-1·d-1)灌胃，每日1次，糖尿病组和筋脉通组灌胃等量的生理盐水，连续灌胃12周，每4周监测血糖、体重。

1.3 组织取材

灌胃12周后禁食过夜，次日空腹测量体重，予12%乌拉坦腹腔注射麻醉，颈动脉取血，离心取血清并分装，-80℃保存，用于检测肝功、血脂。仰卧位固定，开腹取肝脏，称重后置于冰上，切取部分肝组织置于10%中性福尔马林缓冲液固定，用于常规石蜡包埋和病理切片。

1.4 指标检测

肝/体重的比值、肝功、血脂用肝脏重量除以体重以计算肝/体重的比值，采用乳酸脱氢酶法检测大鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)表达，酶法测定血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)水平。

1.5 HE染色

每组随机选择6只大鼠的样本进行HE染色。对各组的肝组织样本进行常规脱水、石蜡包埋、切片后进行HE染色，NanoZoomer数字病理切片扫描仪扫描后利用NDP.view软件导出图片，观察肝组织的病理学改变。由病理学专家读片判定NAFLD活动评分(NAFLD activity score, NAS)。NAS评分(0～8分)：(1)肝细胞脂肪变：0分(<5%),1分(5%～33%),2分(34%～66%),3分(>66%)；(2)小叶内炎症(20倍镜计数坏死灶)：0分(无),1分(<2个),2分(2～4个),3分(>4个)；(3)肝细胞气球样变：0分(无),1分(少见),2分(多见)[8]。

1.6 Masson染色

每组随机选择6只大鼠的样本进行Masson染色。切片常规脱蜡至水，Weigert铁苏木素染色10分钟，酸性乙醇分化液分化，Masson蓝化液返蓝；丽春红品红染色5分钟，磷钼酸溶液分化；苯胺蓝溶液染色10分钟，弱酸工作液浸泡冲洗。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。扫描切片后导出图片。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 血糖、体重结果

造模后各组大鼠体重无明显差异(P>0.05)，自第4周起糖尿病组和筋脉通组大鼠体重较正常对照组显著下降(P<0.05)，糖尿病组和筋脉通组间差异不显著(P>0.05)。造模后糖尿病组和筋脉通组大鼠血糖与正常对照组比较显著升高(P<0.01)，并持续至第12周，糖尿病组和筋脉通组间血糖无明显差异(P>0.05)[9]。

2.2 血脂、肝/体重比值、肝功能、血脂结果

灌胃12周后，各组大鼠血清TC水平无显著性差异(P>0.05)，而糖尿病组大鼠血清TG和FFA表达较正常对照组显著升高(P<0.05)，筋脉通组大鼠TG、FFA水平较糖尿病组大鼠均明显降低(P<0.05)，可见筋脉通可改善TG和FFA异常。结果见表1。

表1 灌胃12周后各组大鼠血清中TC、TG、FFA 的表达情况

注： 与正常对照组比较，aP<0.05；与糖尿病组比较，bP<0.05。

灌胃12周后，糖尿病组和筋脉通组大鼠的肝/体重的比值较正常对照组均显著升高，且有显著统计学差异(P<0.05)。肝功能方面，糖尿病组大鼠血清ALT和AST表达均明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而与糖尿病组相比，筋脉通组大鼠血清ALT、AST水平显著降低，且有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

表2 灌胃12周后各组大鼠肝/体重比值、ALT、AST 的表达情况

注： 与正常对照组比较，aP<0.05；与糖尿病组比较，bP<0.05。

2.3 HE染色结果

形态方面，正常对照组大鼠肝组织肝小叶结构完整、清晰，中央静脉大而壁薄，细胞形态正常；糖尿病组可见弥漫性肝细胞脂肪变，以小泡性脂肪变为主，但未见明显的肝细胞气球样变；肝小叶结构模糊，伴炎症细胞浸润，部分可见坏死灶。筋脉通组肝细胞脂肪变的面积、程度和炎性浸润等情况均明显优于糖尿病组。结果见图1。

2.4 脂肪变性评分、炎症评分、NAS评分结果

与正常对照组相比，糖尿病组的脂肪变性评分和炎症评分均显著升高(P<0.05)，未见明显的气球样变。与糖尿病组比较，筋脉通组的脂肪变性评分和炎症评分明显降低(P<0.05)。计算NAS评分，正常对照组最低，糖尿病组最高，筋脉通组介于两者之间。与正常对照组相比，糖尿病组NAS评分升高(P<0.05)；筋脉通组与糖尿病组相比，NAS评分明显降低且差异显著(P<0.05)。结果见表3。

表3 灌胃12周后各组大鼠脂肪变性评分、 炎症评分NAS评分结果分)

注： 与正常对照组比较，aP<0.05；与糖尿病组比较，bP<0.05。

2.5 Masson染色结果

Masson染色可将胶原纤维染成蓝色，提示组织纤维化程度，细胞浆、肌纤维呈红色，细胞核呈蓝黑色。本实验结果显示，灌胃12周后各组大鼠肝脏组织均未见明显的肝窦周染蓝色。结果见图2。

注：A、B：正常对照组；C、D：糖尿病组；E、F：筋脉通组(A、C、E×200；B、D、F×400)。

图1 各组大鼠肝脏组织HE染色结果

注：A：正常对照组；B： 糖尿病组；C： 筋脉通组。

图2 各组大鼠肝脏组织Masson染色结果(×400)

3 讨论

随着肥胖和代谢综合征的流行，NAFLD已成为中国第一大慢性肝病和健康体检肝功能异常的首要原因[10]。临床以生活方式干预和针对代谢综合征各组分的药物治疗为主，但无临床证据显示这些药物可改善NASH和肝纤维化，间隔肝纤维化和肝硬化是NAFLD患者肝病不良结局的独立预测因素，而NASH更易进展为肝纤维化[11-12]，目前NAFLD缺乏有效治疗方法，亟待深入研究。T1DM是一种多因素免疫介导的疾病，由遗传易感性和环境危险因素相互作用导致，发病年龄轻，血糖较难控制，并发症出现早，其发病机制目前尚未阐明。近年来有学者提出“双重糖尿病”假说，认为部分患者同时具有T1DM(胰岛β细胞被破坏)和T2DM(胰岛素抵抗)的病因[3]，患有双重糖尿病的个体同时存在代谢失调和自身免疫异常，其遗传学特征与T1DM患者极为相似。因此，如果这类患者合并NAFLD，治疗难度更大，且进一步增加心血管疾病患病风险[4]。

中药复方筋脉通主要由菟丝子、女贞子、延胡索、水蛭、细辛、桂枝等药物组成。方中菟丝子配女贞子补益肾之气阴；延胡索行气活血止痛，水蛭为血肉有情之品，配伍延胡索加强活血逐瘀之功；桂枝、细辛振奋气血、温通血脉。全方共奏补肾活血、温通经脉之功效，临床用于治疗糖尿病周围神经病变疗效确切[13]。既往研究证实，筋脉通能够改善T2DM患者及STZ诱导T1DM大鼠糖脂代谢[13-14]，并通过抗氧化应激、抗炎以及抗细胞凋亡等机制而起到神经保护作用[9,15-16]，而糖脂代谢紊乱、炎症及氧化应激等在NAFLD发病中的作用已得到公认。现代药理研究发现，菟丝子中主要活性成分槲皮素[17]，女贞子中提取出的齐墩果酸和熊果酸[18]能够改善NASH肝脏炎症和脂肪变性；天然水蛭素有抗肝纤维化的作用[19]。因此，推测筋脉通对于T1DM大鼠肝脏具有保护作用。

本研究采用单次大剂量腹腔注射STZ成功复制T1DM动物模型[9]。T1DM时胰岛素绝对缺乏，肝脏葡萄糖输出增加，外周组织葡萄糖摄取减少，同时糖酵解生成ATP供能途径受阻，此时机体主要依靠动员脂肪和蛋白质分解来提供能量，最终导致血液葡萄糖和FFA水平显著增高。过多的游离脂肪酸由肝细胞摄取并氧化成脂肪乙酰辅酶A。当肝内乙酰辅酶A过多而超过其氧化利用时，部分转化为TG。当TG合成超过其排泄时则贮积于肝细胞内形成脂肪肝。本研究结果显示，造模成功12周时糖尿病组肝/体重的比值增加，血清TG、FFA水平明显升高，HE染色可见弥漫性肝细胞脂肪变性，以小泡性脂肪变为主，未见明显气球样变，与T2DM诱发的大、小脂滴并存的混合性脂肪肝，伴明显气球样变不同[20]。而筋脉通干预可显著下调肝/体重的比值，减轻血清脂代谢紊乱，改善肝脏脂肪变性。

NASH更易进展为肝纤维化，最终发展为肝硬化和肝癌。本研究结果显示，糖尿病组大鼠血清ALT、AST水平显著升高，提示存在肝细胞损伤；肝组织HE染色可见肝小叶结构模糊，伴炎症细胞浸润，部分可见坏死灶，提示存在肝小叶炎症。而筋脉通治疗可明显减轻血清和肝组织的炎症状态、坏死等，从而起到改善NASH的作用。根据肝脏脂肪变性、炎症以及气球样变程度计算NAS评分可见糖尿病组最高，正常对照组最低，筋脉通组介于两者之间，表明筋脉通可明显减轻肝脏脂肪变性和小叶内炎症。肝组织Masson染色结果显示，T1DM大鼠造模成功12周未见明显窦周纤维化，可能与病程较短有关。

总之，本研究表明T1DM合并NAFLD肝组织学改变以小泡性脂肪变性为主，部分伴灶性炎症细胞浸润、坏死，不伴明显气球样变及纤维化。筋脉通能够改善血清肝功能异常及脂代谢紊乱，减轻肝细胞脂肪变性、炎性浸润和坏死，从而起到肝脏保护作用。进一步深入探索作用机制是今后研究的方向。