基于气相离子迁移谱和顶空固相微萃取的新会柑普茶的风味分析

江津津,谢佩桦,任 芳,赖梓健,欧爱芬

(1.广州城市职业学院食品系,广东广州 510405;2.济南海能仪器股份有限公司 山东济南 250061)

柑普茶是将新会茶枝柑的果肉掏空、生晒、填入普洱茶后,再盖上揭掉的柑皮盖,风干收缩特制而成的一种茶[1]。它融合了新会柑皮(陈皮)浓烈的果皮香味和云南普洱茶醇厚甘香之味,让陈皮与普洱相互融合,兼具新会陈皮和普洱茶的功效[2]。

长期以来,感官品评都是评定茶叶品质优劣的重要方法,但该方法需要有丰富的茶学知识和审评经验[3]。普通消费者很难分辨茶叶质量的优劣,而且感官的灵敏度也易受到外界因素的干扰,从而影响评价结果的准确性、客观性与一致性[4-5]。气相色谱-离子迁移谱技术融合了气相色谱突出的分离特点和离子迁移谱快速响应、高灵敏度的优势,在食品风味分析的应用上受到了广泛的关注[6-10]。气相离子迁移谱(Gas Chromatography-Ion Mobility Spectrometry,GC-IMS)获得的三维矩阵(迁移时间、保留时间和离子强度)能提供更加丰富的化学信息,适用于更高级的数据处理[11]。目前该技术已经应用于食品、中药、烟草、酒类、农业、生物医药、环境检测等领域[12]。不仅可以进行食品风味分析还可以通过检测目标化合物来控制产品质量,甚至可以对环境水样中多环芳烃、多氯联苯等污染物进行分析和毒理学分析,但针对柑普茶这种有浓郁独特气味的特色茶的风味分析应用的研究还不多见。本研究主要利用气相色谱-离子迁移谱技术和风味分析领域常用的顶空-固相微萃取联合气质联用技术(HS-SPME-GC-MS)对新会茶枝柑制得的柑普茶进行挥发性风味和化合物分析,以期为新会柑普茶的风味研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柑普茶 广东新会茶枝柑柑果(新会区三江镇联合村老良围一车间)与云南普洱(勐海产)制得,制作工艺简述如表1。

表1 新会柑普茶与橘红普洱的工艺Table 1 Samples and technology of Xinhui citrus Pu tea and tangerine Pu’er

FA1004N电子分析天平、CU-600电热恒温水槽 上海精密仪器仪表有限公司;CX-200A型中药粉碎机 上海晟喜制药机械有限公司;TG16台式高速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;XT-NS1全自动氮吹浓缩仪 上海新拓分析仪器科技有限公司;Agilent 6890N-5973气相色谱-质谱联用仪 安捷伦科技有限公司;PDMS/DVB固相微萃取萃取头 上海楚定分析仪器有限公司;Checkmate 3顶空分析仪 丹麦Densensor公司;Flavour Spec气相离子迁移谱联用仪 德国G.A.S有限公司,内置500 V/cm电场强度、300 MBq辐射氚(H3)、5 kV漂移电压、98 mm迁移管的IMS标准模块,厚度为0.2 μm,FS-SE-54-CB-115 m ID:0.53 mm气相色谱多毛细管柱。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 T1、T2、T3、T4和T5五组样品分别放入中药粉碎机中粉碎并混合均匀,精确称取1.00 g已均匀粉碎的样品,在顶空样品瓶用沸水(料液比l:6 g/mL)冲泡后立即封口。

1.2.2 GC-IMS检测条件 顶空孵化温度80 ℃、孵化时间10 min,孵化转速500 r/min。载气为高纯氮气(≥99.999%),色谱柱温度40 ℃、色谱运行时间50 min,载气的流速梯度设置为5.00 mL/min保持2 min,在10 min内线性增至50.00 mL/min,在10 min内线性增至150.00 mL/min后保持30 min。顶空进样针温度85 ℃、进样量300 μL[5]。

1.2.3 HS-SPME-GC-MS检测条件 SPME条件:65 μm PDMS/DVB固相微萃取头(实验前在气相色谱进样口250 ℃的条件下老化5 min)在60 ℃条件下平衡5 min,吸附30 min,最后解吸附3.5 min。

GC-MS条件:弹性石英毛细管柱(HP-5柱,30 m×0.25 mm×0.25 μm),进样口温度:250 ℃,ECD检测器温度:250 ℃,载气:高纯氦气(纯度>99.999%),流速:1.0 mL/min,柱温:起始50 ℃,保持5 min,随后3 ℃/min升至125 ℃,保持3 min,随后以2 ℃/min升至180 ℃,柱温180 ℃,保持3 min;最后以15 ℃/min升至230 ℃。分流比为50∶1。离子源EI,离子源温度230 ℃,电子能量70 eV,发射电流34.6 μA,四极杆温度150 ℃,转接口温度:280 ℃,电子倍增器电压350 V,质量扫描范围:35～400 amu[3]。

1.3 数据处理

仪器配套的分析软件包括LAV(Laboratory Analytical Viewer)和三款插件以及GC×IMS Library Search,不同的分析软件有不同的分析方向:LAV用于查看分析谱图,图中每一个点代表一种挥发性有机物;对其建立标准曲线后可进行定量分析;Reporter插件直接对比样品之间的谱图差异(二维俯视图和三维谱图);Gallery Plot插件指纹图谱对比,直观且定量地比较不同样品之间的挥发性有机物差异;Dynamic PCA插件动态主成分分析,用于将样品聚类分析,以及快速确定未知样品的种类;GC×IMS Library Search应用软件内置的NIST数据库和IMS数据库可对物质进行二维定性分析,用户可根据需求利用标准品自行扩充数据库。

2 结果与分析

2.1 Reporter插件直接对比橘红普洱、胎柑与柑普茶中挥发性有机物的差异

2.1.1 直接对比橘红普洱及柑普茶中挥发性有机物的差异 图1背景为蓝色,横坐标1.0处红色竖线为RIP峰(反应离子峰,经归一化处理),由图1可以直观的看出,T5-1(橘红普洱)的挥发性化合物与T2-1、T3-1、T4-1(柑普茶)之间有明显差异。橘红普洱中挥发性有机物的种类的含量相比柑普茶少,点的个数和颜色比后三者少且浅;T2～T4图中圈出的物质,随着小青柑的生长期不同,部分挥发性有机物消失(点的个数少了),部分挥发性有机物含量降低(点的亮度浅了),具体所指的挥发性有机物见指纹图谱。定性分析结果和感官分析结果也显示普洱和柑普茶中的风味物质存在显著的差异。

图1 橘红普洱与柑普茶中的挥发性有机物差异对比Fig.1 Comparison of volatile organic compoundsin tangerine Pu’er and citrus Pu tea

2.1.2 直接对比胎柑及柑普茶中挥发性有机物的差异 图2直接对比了胎柑及3种柑普茶中挥发性有机物的差异,图2中圈出的挥发性有机物含量在胎柑(T1)及普柑茶(T2、T3、T4)中各不相同,原因为新会柑柑皮在不同成熟期,挥发性有机物含量存在差异。柑普茶中挥发性有机物的总体含量少于胎柑(T1),胎柑是每年3～4月采摘的新会柑幼果干燥制成的,在新会茶枝柑植株的第一次生理落果期前摘取,属胎果,个头小小的,里面还没有长肉,也不含普洱茶的成分。胎柑保留了绝大部分的柑油(挥发油95%以上)成分,因此其风味非常强烈,挥发性化合物更为丰富。由图2可见,从同株茶枝柑植株上采摘的不同成熟期的柑果的皮在制成柑普茶之后,所含的特征挥发性有机物的含量有明显差异,也可以据此来判断柑普茶的类别。

图2 胎柑与柑普茶中的挥发性有机物差异对比Fig.2 Comparison of VOCs incitrus embryo and citrus Pu tea

2.1.3 直接对比小青柑、青柑和二红柑中挥发性有机物的差异 图3比对了T2小青柑、T3青柑和T4二红柑的挥发性有机物的差异,由图3可见,三类样品的挥发性有机物相似,但含量明显不同。T2～T4中,青柑的成熟度(生长周期)不同,则所含的挥发性有机物的种类与含量不同,导致三类样品中挥发性有机物的种类和含量不同。例如:异丁醛Isobutanal在T2样品中含量最高,随着柑的成熟,该物质的含量逐渐降低,且在T4二红柑样品中消失;丙基甲基酮在T2样品中含量最低,随着柑的成熟,该物质的含量逐渐升高。

图3 三类柑普茶中的挥发性有机物差异对比Fig.3 Comparison of volatile organic compoundsin three types of citrus Pu tea

2.2 Gallery Plot插件分析样品中的挥发性有机物指纹图谱

橘红普洱、柑普茶及胎柑样品中的挥发性有机物指纹图谱如图4所示,为了找寻规律,选取样品间变化规律明显的挥发性有机物放大显示,由图4a可以看出,区域B标出的物质可视为橘红普洱的指纹图谱,代表性化合物包括戊醛、己醛、环己酮等;但新会柑普茶中该类物质的含量较少,区域B中的2-己烯-1-醇、苯乙醛等化合物在柑普茶样品中有出现且含量随着柑果的成熟而增加。上述化合物在胎柑(T1)中均不存在,说明这些化合物可能源于普洱茶的风味。图4b为截取的胎柑的特征指纹峰,大约有50种化合物,如芳樟醇、α-蒎烯、1-丙醇、2,6-二甲氧基苯酚等,此类化合物可被认为是T1的特征风味化合物。由图4c可知,区域B标出的物质随着新会柑柑果的成熟,在样品中的含量逐渐增加,如编号为1～18的化合物,这些挥发性化合物包括α-蒎烯、柠檬烯、芳樟醇、苯乙基醋酸酯、3甲基-丁醛等。含量增加的原因极可能是随着柑果的成熟,柑皮表面积增加[13],源于柑皮的特征性挥发性化合物含量也随之增加。上述挥发性有机物在橘红普洱中含量极低,可初步判断该类物质的来源为新会柑的柑皮。

图4 橘红普洱及柑普茶的整体挥发性有机物分析的部分指纹谱图Fig.4 Partial fingerprints of volatile organic compounds in citrus Pu tea and tangerine Pu’er

由图4d可知,区域A为柑普茶T4二红柑的特征指纹峰,其中区域A标出的物质在T4样品中含量最高,该类物质在不同成熟期制得的柑普茶中含量不同,是影响柑普茶风味的关键。这类物质包括α-蒎烯、1-辛烯醇、苯乙基醋酸酯和2,6二氯苯酚等,其形成机理与新会茶枝柑的成熟过程的相关性有待进一步验证。由图4e可见,区域A所含物质在青柑茶T3中含量最高,与T2和T4两个样品一样,这部分化合物源于新会柑皮的贡献,也是影响柑普茶风味的主要因素。A区域标注出的物质2-苯乙醇、图中的5～36号化合物在T5橘红普洱样品中含量非常高,在其他样品中的含量非常少;B区域标出的物质在T5橘红普洱中含量最高,而在青柑样品中含量非常低,如异丁醛、丙基甲酮、乙基甲酮、环己酮、己醛、戊酸乙酯、2-己-1-醇、环己酮、丁酸乙酯等物质。3-甲基丁烷、芳樟醇、α-蒎烯、3-己烯醇、1-丙醇、苯甲醛、丙酸乙酯、2,3-戊二酮等物质在小青柑中含量非常高。异丁醛、乙基甲酮、2,3-戊二酮等物质在T2中含量最高,随着柑的成熟,该物质的含量逐渐降低,且在(二红柑)T4样品中消失;乙酸乙酯、2,6-二氯苯酚等物质在(青柑)T3样品中含量最高,在其他两种茶中的含量非常低;丙基甲酮、3-甲基丁醛、戊醇等物质在小青柑样品T2中含量最低,随着柑的成熟,该物质的含量逐渐升高。

2.3 橘红普洱、柑普茶及胎柑的聚类分析(动态主成分PCA分析)

运用PCA插件做样品的聚类分析,结果如图5所示,橘红普洱、胎柑及柑普茶分别聚成三类,其中柑普茶(T2、T3、T4)自聚在一起,3组柑普茶样品的气味较为相近,与橘红普洱(T5)和胎柑(T1)的差异较大。取柑普茶样品再进行PCA分析如图6。由图6可知,三类柑普茶(T2、T3、T4)的挥发性风味仍然存在明显差异,气相离子迁移谱技术可针对不同品种的柑普茶进行快速分类鉴别。

图5 普洱、柑普茶及胎柑的PCA分析Fig.5 PCA analysis of Pu’er,citrus Pu tea and citrus embryo

图6 三类柑普茶的聚类分析Fig.6 Cluster analysis of citrus Pu tea

2.4 GC-IMS对样品的挥发性有机物的定性结果

由表2可见,三类柑普茶(T2、T3、T4)中的风味物质的含量,即特征挥发性有机化合物的含量随新会柑的成熟期不同而不同。T1中没有检测出辛醛、2-乙酰氟铀、戊酸乙酯、环己酮、乙酸丁酯、戊醛、2-戊酮成分,而这些成分均在T2～T5样品中有检出。这些挥发性有机物在胎柑T1中含量几乎不存在,可初步判断这类物质源于普洱茶的风味贡献[14-16]。3-甲基丁酸、1-己醇、苯乙醛是T1、T2的特征风味物质。二甲基二硫醚只存在于T1、T2、T3样品中。T1～T4含有T5没有检测出来的风味物质,分别为:芳樟醇、2-己醇、(Z)-3-己烯-1-醇、α-松油醇、香兰素、β-蒎烯,而且,这类风味化合物随着新会柑的成熟,含量在逐渐减少直至消失。

表2 样品的挥发性有机物定性结果Table 2 Qualitative analysis of volatile organic compounds in samples

丁香酚、2-庚酮、2-甲基吡嗪、丙酸乙酯、丙烯酸乙酯是T1的特征风味化合物,初步认为这些风味物质只存在胎柑。4-甲基-2-戊酮为T2样品的特征风味物质;丁醛、2-乙基呋喃为T2、T3的特征风味物质。根据此类特征性有机物,可判断新会柑普茶的品种。

2.5 HS-SPME-GC-MS分析结果

运用HS-SPME-GC-MS对样品的挥发性成分进行定量分析,挥发性化合物组成如表3所示。

表3 样品的挥发性成分组成Table 3 Composition of volatile components in samples

由表3可以看出,样品挥发性成分组成以酯类、醇类和碳氢化合物为主。柑胎(T1)含有41.45%的碳氢化合物(其中21.60%为烯烃类),21.35%酯类,17.57%酚类,12.27%醇类,3.79%杂氧化合物,醛类、酮类、酸类和含氮化合物含量相对较少。小青柑(T2)含有42.17%的酯类,20.54%醇类,13.73%酚类,7.79%的碳氢化合物(其中4.74%为烯烃类),5.80%杂氧化合物,醛类、酮类、酸类和含氮化合物含量相对较少。青柑(T3)含有42.16%的酯类,24.40%的碳氢化合物(其中20.79%为烯烃类),10.42%醇类,8.15%酚类,5.58%酸类,3.40%杂氧化合物,醛类、酮类和含氮化合物含量相对较少。二红柑(T4)含有37.70%的酯类,18.76%的碳氢化合物(其中10.86%为烯烃类),12.29%醇类,6.39%酸类,5.32%杂氧化合物,4.60%酮类,醛类和含氮化合物含量相对较少。橘红普洱(T5)含有49.08%的碳氢化合物(其中1.81%为烯烃类),12.59%的酯类,9.37%酸类,8.68%杂氧化合物,6.61%酮类,4.78%含氮化合物,3.92%醇类,醛类和酚类含量相对较少。样品主要挥发性成分为柠檬烯、γ-松油烯、2-甲基氨基-苯甲酸甲酯、蒎烯、松油醇、N一甲基邻氨基苯甲酸甲酯、邻伞花烃和1,2,3-三甲氧基苯等,这个结果与之前的GC-IMS 分析结果相一致,与前人对普洱茶风味和陈皮风味化合物的研究结论也较为吻合[17-19]。

3 结论与讨论

使用气相色谱-离子迁移谱技术,在无需真空的前提下,经顶空进样后可快速检测柑普茶中的挥发性有机物。样品的特征指纹峰因新会柑皮所处的成熟期不同而发生变化,有些物质含量减少,如戊醛(Pentanal)、己醛(Hexanal)、环己酮(Cyclohexanone)等,有些物质含量随着柑皮的生长期的增加逐渐增多,如2-己烯-1-醇(2-Hexen-1-ol)、苯乙醛(Benzenacetaldehyde)等,可根据此类物质的相对含量判断柑皮所处的成熟期,从而对新会柑普茶进行快速分类鉴别。芳樟醇、α-松油醇、香兰素、α-蒎烯等化合物是柑普茶区别于其他普洱茶的特征风味化合物。HS-GC-MS的分析结果显示样品的挥发性成分组成中以酯类、醇类和碳氢化合物为主,分析结果与GC-IMS的分析结果相辅相成。柑普茶挥发性风味成分以酯类、碳氢化合物和醇类为主,主要挥发性成分为柠檬烯、γ-松油烯、2-(甲基氨基)-苯甲酸甲酯、松油醇、N一甲基邻氨基苯甲酸甲酯、邻伞花烃和1,2,3-三甲氧基苯等,其香气成分来自柑普茶的柑皮和普洱熟茶,兼备二者的香气特征。通过建立柑普茶的PCA模型,可以快速鉴别柑普茶的类别及品质。若能完善进一步完善GC-IMS的数据库的VOCs信息,并将分析结果与化学计量学方法结合[20],则更有利于探明不同种类柑普茶的活性化合物。