鸡胚肽锌螯合物的制备工艺及免疫调节功能研究

吴明泽,王 垒,王 笑,李 婷,胡祥昊,董丹华,李亚男,马青琳,代 龙,高 鹏,*

(1.山东中医药大学药学院,山东济南 250355;2.凯莱英生命科学技术(天津)有限公司,天津 300457;3.山东省文登整骨医院药学部,山东威海 264400;4.滨州医学院药学院,山东烟台 264003)

鸡胚蛋又称“活珠子”,是南京著名的特产,属金陵小吃。李时珍《本草纲目》中有记载:“鸡胚蛋,性温无毒,主添精,助气益血,扶虚,治男女虚劳,矢志恍惚。”可见鸡胚可能具有一定的增强免疫的功能。研究表明,鸡胚经过酶解可降低蛋白的过敏原性,获取一些具有重要生物活性的小肽[1]。锌对增强人体内的体液及细胞的免疫功能意义重大,能够增强吞噬细胞吞噬病原体的功能,调整病变组织周围的血流量及物质代谢,从而达到增强局部和整体机能状态的目的[2]。而传统的补锌剂如硫酸锌等,存在吸收率差、副作用大、易刺激肠胃、在体内蓄积中毒等[3]问题,肽与微量元素的螯合产物可以避免这些问题,它不仅能促进肽的吸收,同时也能补充人体所需要的微量元素。

近年来,对于肽螯合微量元素免疫活性的研究逐渐增加。左爱玲[4]发现钙螯合胶原肽能够在防治骨质疏松的同时,增强正常大鼠的免疫力。张智等[5]发现玉米肽锌螯合物能够能提高非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫功能。梁营芳等[6]发现适量的带鱼酶解蛋白亚铁螯合肽可以提高对虾的免疫相关指标。针对鸡胚肽的活性研究相对较少,Xue等[7]对鸡胚抗氧化活性肽进行了分离纯化及结构鉴定,而螯合微量元素的鸡胚肽活性研究尚未见报道。

因此,本实验以鸡胚蛋为原材料,通过分步酶解法制备鸡胚肽,将鸡胚肽与锌元素螯合,以螯合率为指标进行单因素实验考察,响应面法优化螯合工艺,筛选出最佳螯合工艺,结合免疫调节药效学研究验证其药效。通过本实验可探索鸡胚肽锌螯合物的免疫活性研究,为以后鸡胚肽在功能性食品及保健食品等开发提供一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡胚蛋浙江省 南京六合丹田农场;昆明种封闭群无菌型小白鼠(体重20±2 g),健康状况良好,共60只,雌雄各半,动物合格证号:SCXK(鲁)2017-0011 济南朋悦实验动物繁育有限公司;胰蛋白酶(100000 U/g)、碱性蛋白酶(100000 U/g) 上海源叶生物科技有限公司;茚三酮、铬黑T(均为分析纯) 济南跃阳化工有限公司;锌单元素 中国计量科学研究院;3,3′-二氨基联苯胺、乙二胺四乙酸二钠盐、乙二胺四乙酸(均为分析纯) 天津金汇太亚化学试剂有限公司;注射用环磷酰胺 江苏恒瑞医药股份有限公司。

R-301型旋转蒸发器 上海申顺生物科技有限公司;GZX-9030MBE型电热鼓风干燥箱 吴江宏昌有限公司;DS-1型高速组织捣碎机 无锡沃信仪器有限公司;JM-L50型胶体磨 上海诺尼轻工机械有限公司;PK-S24型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;SW-CJ-2FD型磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;JM-L50型冷冻干燥机 上海诺尼轻工机械有限公司;FE-20型pH计 梅特勒仪器有限公司;UV1100型紫外可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司;AB135-S型十万分之一天平、AL-204型万分之一天平 上海精科实业有限公司;JB-500型精密扭力天平 上海维菱科学仪器有限公司;DT5-2型离心机 北京时代北利离心机有限公司;iCE 3300 AAS型原子吸收光谱仪 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;TANK PRO型微波消解仪 上海新仪微波化学科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鸡胚肽冻干粉的制备 将鸡胚蛋洗净,去壳,用组织捣碎机高速捣碎,加入8倍量去离子水,胶体磨对其进行匀浆处理,煮沸20 min,进行高温杀菌,待温度降至55 ℃,调节pH至8.0,加入3%的碱性蛋白酶,酶解3 h;待降温至37 ℃,加入2%的胰蛋白酶,继续酶解2 h;煮沸,高温杀酶15 min,迅速冷却至室温,放置冰箱低温(4 ℃左右)冷藏过夜,离心(4500 r/min)10 min,取上清液,浓缩,-24 ℃预冷冻5 h(或-80 ℃预冷冻1 h),冷冻干燥24 h(-45 ℃,23 Pa),得鸡胚肽冻干粉。

1.2.2 鸡胚肽螯合锌元素的工艺 取鸡胚肽冻干粉,加适量的水溶解,在一定的螯合pH条件下,按照需要的比例加入一定的锌溶液混合均匀,在一定温度下螯合一定时间,用95%乙醇醇沉,将醇沉液置于低温高速离心机中在4500 r/min条件下离心20 min,取沉淀物,将沉淀物加入95%乙醇进行二次洗涤后,离心,将制得的鸡胚肽锌螯合物,置于-24 ℃下预冷冻5 h(或-80 ℃下预冷冻1 h),放置于冻干机中冻干24 h(-45 ℃,23 Pa),粉碎,即得鸡胚肽锌螯合物冻干粉。

1.2.3 单因素实验 以螯合率及螯合物得率为考察指标,进行单因素实验[8],分别考察螯合pH(A)、螯合温度(B)、鸡胚肽与锌浓度比(C)、螯合时间(D)对鸡胚肽锌螯合反应的影响,每个因素5个水平。在螯合温度70 ℃、鸡胚肽与锌浓度比为2.0∶1、螯合时间2.0 h条件下考察螯合pH的影响,水平设置为6、7、8、9、10;在螯合pH为8、鸡胚与锌浓度比为2.0∶1、螯合时间为2.0 h条件下考察螯合温度的影响,水平设置为50、60、70、80、90 ℃;在螯合pH8、螯合温度70 ℃、螯合时间2.0 h条件下考察鸡胚肽与锌浓度比的影响,水平设置为1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1;在螯合pH为8、螯合温度70 ℃、鸡胚肽与锌浓度比为2.0∶1条件下考察螯合时间的影响,水平设置为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

1.2.4 响应面法优化实验 在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken实验设计原理[9],以螯合率为指标,选取螯合pH(A)、螯合温度(B)、鸡胚肽与锌浓度比(C)以及螯合时间(D)四个因素为自变量,采用软件Design-Expert V8.0.6.1设计四因素三水平的响应面分析实验,因素与水平设计如表1。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 螯合率、螯合物得率的测定 螯合率的测定首先根据GB 5009.14-2017《食品中锌的测定》的测定方法进行测定鸡胚肽锌螯合物中锌的质量。其中原子吸收光谱仪设定参数为:测定波长为213.9 nm,通带0.2 nm,灯电流为75%,燃气流量为1.2 L/min,燃烧器高度为7.0 mm,计算螯合率和螯合物得率。

式(1)

式中:M0:反应体系锌的总质量,mg;M1:鸡胚肽中锌的质量,mg;M2:鸡胚肽锌螯合物中锌的总质量,mg。

式(2)

式中:W0:反应物的总重量,mg;W1:反应生成的螯合物重量,mg。

1.2.6 鸡胚肽锌螯合物的免疫调节实验 免疫调节实验采用免疫器官-胸腺和脾脏质量指数法[10]测定。将小鼠随机分为5组,每个剂量组12只,共60只。小鼠适应性培养5 d,饲养环境为屏障环境,环境温度为22～26 ℃、相对湿度为50%～70%,饲养室提供12/12 h的昼夜交替时间,非工作时间使用动物照度[11]。小鼠正常饮食采水,每天灌胃1次,灌胃剂量1 mL/100 g,共灌胃30 d[12]。正常对照组、模型组生理盐水给药;实验组:富锌鸡胚肽低、中、高剂量组给药浓度分别为5、10、20 mg/mL。在灌胃的最后4 d开始在模型组和实验组腹腔注射0.25 mL的环磷酰胺注射液,注射时间为灌胃后4 h,注射药物期间小鼠饮食采水量相对减少,活动和精神状态减弱[13],体重增加值、饲料效率等指标与正常对照组无显著差异(P>0.05),在最后1次注射环磷酰胺2 h后处死所有小鼠,称重,迅速剖取胸腺和脾脏组织,用滤纸吸去表面血液,在精密扭力天平上称重,计算胸腺和脾脏质量指数。

式(3)

式(4)

式中:m0:小鼠质量,g;m1:胸腺组织质量,g;m2:脾脏组织质量,g。

1.3 数据处理

实验数据均以“平均值±标准偏差”表示(n=3)。采用SPSS 22.0统计分析软件进行单因素方差分析(ANOVA)[14]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

不同螯合pH对鸡胚肽螯合率及螯合物得率的影响如图1所示,在螯合pH为6～8时,鸡胚肽螯合率随着pH的升高而迅速升高,在pH为8时最高;pH为8～10时,螯合率随着pH的升高而降低,这可能由于碱性环境下Zn(OH)2的生成争夺了Zn2+或碱性条件抑制了肽的活性。螯合物得率在pH为10时最高,这也可能由于Zn(OH)2沉淀析出,导致螯合物得率虚高[15]。因此选择pH7、8、9为响应面优化实验螯合pH的三个水平。

图1 螯合pH对螯合率及螯合物得率的影响Fig.1 Effect of chelating pHon chelation rate and chelate yield

不同螯合温度对鸡胚肽螯合率及螯合物得率的影响如图2所示,在50～70 ℃时,鸡胚肽螯合率及螯合物得率随着螯合温度的升高而迅速升高;在70 ℃时螯合率最高,可能随着温度的升高,反应体系的分子运动加快,易于锌离子螯合的氨基酸残基和位点暴露出来[16],从而导致螯合率及螯合物得率的升高。螯合温度为70～90 ℃,随着螯合温度增加,螯合率及螯合物得率逐步降低,可能高温导致鸡胚肽活性降低,或者生成的肽锌螯合物结构不稳定[17],从而导致螯合率及螯合物得率的降低。因此选择60、70、80 ℃为响应面优化实验螯合温度的三个水平。

图2 螯合温度对螯合率及螯合物得率的影响Fig.2 Effect of chelating temperatureon chelation rate and chelate yield

不同鸡胚肽与锌浓度比实验结果如图3所示,在1.0∶1～2.0∶1浓度比下,随着鸡胚肽与锌浓度比的增加,螯合率及螯合物得率呈逐渐增加的态势;当浓度比大于2.0∶1时,螯合率及螯合物得率增长趋势不明显,可能随着浓度比的增长,锌与鸡胚肽的螯合作用逐渐饱和,过量的鸡胚肽与锌离子的螯合能力不断减弱,故而螯合率及螯合物得率不再大幅增长。因此,选择1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1为响应面优化实验鸡胚肽与锌浓度比的三个水平。

图3 鸡胚肽与锌浓度比对螯合率及螯合物得率的影响Fig.3 Effect of concentration ratio of chicken embryopeptide to zinc on chelation rate and chelate yield

不同螯合时间实验结果如图4所示,当螯合时间不断增长时,螯合率及螯合物得率也在不断逐渐增加,在2.5 h之前,螯合率及螯合物得率增加较快,此后再随着时间的推移螯合率及螯合物得率变化不大,可能2.5 h时,鸡胚肽中易与锌螯合的氨基酸残基及位点基本饱和,所以螯合率及螯合物得率增长极少,考虑到经济及效率等因素,缩短螯合时长,故选择1.5、2.0、2.5 h为响应面优化实验螯合时间的三个水平。

图4 螯合时间对螯合率及螯合物得率的影响Fig.4 Effect of chelating time onchelation rate and chelate yield

2.2 响应面优化实验结果

2.2.1 响应面实验设计及结果 综合单因素实验结果,选取螯合pH(A)、螯合温度(B)、鸡胚肽与锌浓度比(C)、螯合时间(D)为自变量,以螯合率(Y)为响应值,根据Box-Behnken设计原理进行响应面实验[18],实验设计方案和结果如表2所示。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

表3 螯合率回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance of chelation rate regression equation

图5 双因素交互作用影响螯合率的等高线及三维曲面图Fig.5 Contour line and three-dimensional surface map of two-factor interaction affecting chelation rate

2.2.2 最佳螯合条件的确定及验证 通过Design Expert V8.0.6.1分析得到以螯合率为指标的最佳螯合条件为螯合pH8.04,螯合温度70.98 ℃,肽锌浓度比为2.31∶1,螯合时间2.19 h,此时的螯合率预测值为49.79%,结合实际操作及经济可行性,将螯合条件调整为pH8.0,螯合温度70 ℃,肽锌浓度比为2.3∶1,螯合时间2.2 h,在此条件进行三次实验,测得螯合率为48.98%±0.35%,与预测值接近,其相对误差为0.41%,说明在此螯合条件下的回归方程模型可靠。此时螯合物得率为38.04%±0.26%,得率较高且稳定。

2.3 鸡胚肽锌螯合物免疫调节作用

当机体含锌总量下降时,机体的免疫功能降低,免疫器官的重量会减少五分之一甚至五分之二[21]。免疫器官是抵抗外来有害物质的基础,免疫器官受损会造成免疫功能细胞的减少及降低机体的免疫力,从而造成机体易感疾病[22]。因此,增加免疫器官的重量势必对人体的免疫力有很大的提升,免疫器官-胸腺和脾脏质量指数的变化能够反映免疫调节方面的变化[23]。

由表4可以看出,模型组与正常对照组有显著差异,说明对模型对照组的小鼠注射环磷酰胺后,小鼠的胸腺质量指数与脾脏质量指数显著(P<0.05)下降,这可以表明小鼠的胸腺和脾脏器官的发育受到了环磷酰胺的抑制作用,小鼠胸腺和脾脏的受损模型建模成功[24]。富锌鸡胚肽高剂量组与模型组有显著(P<0.05)差异,说明富锌鸡胚肽对于环磷酰胺注射液所造成的免疫器官的萎缩具有明显的促生长以及增重的作用,富锌鸡胚肽能够使胸腺和脾脏的质量指数增大,且随着服用剂量的加大,质量指数逐渐增加。在一定范围内,富锌鸡胚肽具有一定的免疫调节功能。

表4 鸡胚肽锌螯合物对小鼠免疫器官-胸腺、脾脏质量指数的影响Table 4 Effect of chicken embryonic peptide zinc chelateon the immune index of thymus and spleen in mice

3 结论

本实验以鸡胚蛋为原料,先用碱性蛋白酶后用胰蛋白酶进行酶解后制备鸡胚肽。以螯合率及螯合物得率为指标,进行单因素实验,再以螯合率为指标,利用响应面法优化制备鸡胚肽锌螯合物,得到的最优螯合工艺为:螯合pH8,螯合温度 70 ℃,鸡胚肽与锌的浓度比为2.3∶1,螯合时间2.2 h,此时的螯合率为48.98%±0.35%,螯合物得率为38.04%±0.26%,通过免疫器官-胸腺和脾脏影响研究发现,适宜剂量的富锌鸡胚肽能使小鼠的胸腺和脾脏的质量指数明显增大,说明通过双酶酶解制备的鸡胚小肽与锌元素的螯合物具有一定的免疫调节功能,并呈现一定的量效关系。但本实验只针对机体免疫器官的重量进行了考察,不能完全代替机体的免疫功能,淋巴细胞的生长过程、发挥作用的阶段及基因信号转导等方面均是免疫的物质基础[25],因此全方位的药效学实验才能证实鸡胚肽-锌螯合物对机体免疫调节的影响。由于实验水平及条件的限制,这些方面需进一步的考察。