乳核散结胶囊中相关药材薄层色谱鉴别

张雪梅 ，张刘伟 ，梁宗锁 ，彭玉婷 ，刘景玲

（1.西北农林科技大学化学与药学院，陕西 咸阳 712100； 2.浙江理工大学生命科学学院，浙江 杭州310038； 3.西北农林科技大学生命科学学院，陕西 咸阳 712100）

乳核散结胶囊由当归、黄芪、柴胡、淫羊藿等10味中药材组方，与2015年版《中国药典(一部)》中的乳核散结片的配方一致，具有舒肝活血、祛痰软坚功效，可用于治疗乳房肿块结节、质软或中等硬、经前疼痛加剧、乳房胀痛等症状[1-2]。目前，仅有少数关于其功效类似中成药的鉴别方法[3-4]。2015年版《中国药典(四部)》中，仅有乳核散结片中当归和淫羊藿的定性鉴别，未曾提到其他药材。为有效控制此制剂的有效性和内在质量，本研究中采用薄层色谱（TLC）法分别对其中柴胡、鹿衔草、当归、黄芪进行定性鉴别，为《中国药典》中乳核散结片质量标准的修正和完善提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AUW120型分析天平（日本岛津公司，精度为0.1mg）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为 250 W，频率为 40 kHz）；MH-2000型调温型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）；SHB-ⅢS型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；XMTD-8222型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；KDC-140HR型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；DK-8D型三孔电热恒温水槽（上海齐欣科学仪器有限公司）；薄层层析硅胶G板（青岛海洋化工厂，规格为10 cm×10 cm）；薄层层析硅胶H板（青岛海洋化工厂，规格为10 cm×20 cm）。

1.2 试药

当归对照药材（批号为 120927-201516），黄芪甲苷对照品（批号为 110781-200613），柴胡皂苷 a对照品（批号为110777-201510），鹿衔草对照药材（批号为121211-201202），均购自中国食品药品检定研究院；乳核散结胶囊（杨凌华盛生物制药有限公司，批号分别为170201，170301，170302，20180303，150808，20171101，170806，规格为每粒 0.43 g）；水为蒸馏水；对二甲氨基苯甲醛粉末；石油醚、甲醇、三氯甲烷、正丁醇、浓氨水、乙酸乙酯、乙醇、硫酸、甲苯、甲酸乙酯、甲酸、正己烷等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 柴胡

溶液制备：取5批样品各10 g，研细，置锥形瓶中，加60～90℃石油醚 50 mL，超声处理 20 min[5-7]，滤过。取滤渣，置水浴上挥尽残留的石油醚，加甲醇50 mL，加热回流30 min，滤过，滤渣用少量甲醇洗涤，将洗液与滤液合并，并浓缩至干，残渣加水10 mL，加热使其溶解[8-9]，放冷，溶液置离心管中离心 10 min（10 000 r／min），取离心后的上清液，于分液漏斗中，加三氯甲烷，振摇提取2次，每次15 mL，弃去三氯甲烷液，水液再用水饱和的正丁醇振摇提取 3次（10，10，5 mL），合并正丁醇提取液，最后用氨试液提取 3 次（15，15，5 mL），弃去氨液，将正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[10-11]。另取柴胡皂苷a对照品，加甲醇制成质量浓度为 1 mg ／mL 的溶液，作为柴胡对照品溶液[7，12-13]。另取不含柴胡的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法配制阴性对照品溶液。

薄层色谱鉴别：参考2015年版《中国药典（四部）》0502 通则中 TLC 法[14]，吸取上述溶液各 10 μL[15]，分别点于已饱和30 min的同一硅胶G薄层板上[12]。以乙酸乙酯 -乙醇 -浓氨试液 -水（8∶2∶0.5∶1，V／V／V／V）为展开剂[16]，展开，取出，晾干，再次进行二次展开，取出，晾干；喷以2%对二甲氨基苯甲醛40%硫酸溶液，用热风吹至斑点显色为止[17]。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，而阴性对照品溶液在相应位置上并未检出斑点[18]。详见图1。

图1 柴胡薄层色谱图

2.2 鹿衔草

溶液制备：取3批样品各5 g，加甲醇50 mL，加热回流30 min，滤过，将滤液蒸干，残渣加水10 mL，加热使其溶解[19]，用水饱和正丁醇进行振摇提取3次（10，10，5 mL），合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[10，20]。另取鹿衔草对照药材 0.5 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使其溶解，作为对照药材溶液[21]。另取不含鹿衔草的阴性样品，按供试品溶液制备方法配制阴性对照品溶液。

薄层色谱鉴别：参考2015年版《中国药典（四部）》0502 通则中 TLC 法[14]，吸取上述溶液各 10 μL[15]，分别点于已饱和30 min的同一硅胶G薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯 -甲酸（5∶4∶0.5，V／V／V）上层溶液为展开剂[21]，展开，取出，晾干，再次展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇液[1]，在60℃烘至斑点显色清晰。日光下观察，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，而阴性对照品溶液在相应位置上未检出斑点[18]。置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照品溶液在相应位置上未检出斑点[18]。详见图2。

图2 鹿衔草薄层色谱图

2.3 当归

溶液制备：取3批样品各10 g，研细，置锥形瓶中，加石油醚（60 ～90 ℃ ）50 mL，超声 20 min[5-7]，滤过，滤液挥至约0.5 mL，作为供试品溶液。另取当归对照药材1 g，加石油醚（60～90 ℃ ）15 mL，超声处理 20 min，滤过，滤液挥至约1 mL，将其作为对照药材溶液[8]。另取不含当归的阴性样品，按供试品溶液制备方法配制阴性对照品溶液[22]。

薄层色谱鉴别：参考2015年版《中国药典（四部）》0502 通则中 TLC 法[14]，吸取上述溶液各 2 μL[15]，分别点于已饱和30 min的同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（9 ∶1，V／V）为展开剂，展开，取出，晾干[23]，置紫外光灯（365 nm）下检视[24]。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照品溶液在相应位置上未检出斑点[18]。详见图3。

图3 当归薄层色谱图（紫外光灯365 nm）

2.4 黄芪

溶液制备：取3批样品各10 g，研细，置锥形瓶中，加石油醚（60～90 ℃ ）50 mL，超声处理 20 min[5-7]，滤过；取滤渣，置水浴上挥尽残留的石油醚，加甲醇50 mL，加热回流 30 min，滤过，滤渣用少量甲醇洗涤，与滤液合并，浓缩至干，剩余残渣加水10 mL，加热使溶解[8]，放冷，溶液置离心管中离心10 min（转速为3 500 r／min），取上清液置分液漏斗中，加三氯甲烷，振摇提取2次，每次15 mL，弃去三氯甲烷液[25]后的水液再用水饱和的正丁醇振摇提取 3次（10，10，5 mL），合并正丁醇提取液，最后用氨试液提取 3次（15，15，5 mL），弃去氨液[10]，将正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇分别制成质量浓度为1 mg／mL的溶液，作为对照品溶液[7，11-12]。另取不含黄芪的阴性样品，按供试品溶液制备方法配制阴性对照品溶液。

薄层色谱鉴别：参考2015年版《中国药典（四部）》0502通则中TLC法[14]，吸取空白样品和供试品溶液各10 μL[15]，对照品溶液 5 μL，分别点于已饱和 30 min 的同一硅胶H薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V／V／V）10℃以下放置的下层溶液为展开剂[26-28]，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液[29]，在105℃烘至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，而阴性对照品溶液在相应位置上未检出斑点[18]。详见图4。

图4 黄芪薄层色谱图

3 讨论

在TLC鉴别中，主要是要利用吸附剂对样品中各个组分吸附能力的不同，以及展开剂对这些样品的解吸附能力的不同，达到使各组分分离的目的[30]。以TLC进行定性鉴别时，常会出现人为误差或对一些条件选择的不合理，如点样操作的熟练程度、把握点样的浓度、溶液制备、展开剂比例等，均会导致试验不成功。

主药柴胡的TLC鉴别中，对展开剂、显色剂和干燥方法进行了研究。最初采用乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-浓氨试液 -水（10∶5∶5∶1∶1，V／V／V／V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛40%硫酸乙醇溶液，在60℃烘至斑点显色[3]。60℃烘出来的薄层板只有对照品溶液显红色，供试品溶液呈现黑色，后换成热风吹干，但供试品溶液仍未显2015年版《中国药典》中所描述的与供试品溶液颜色相同的斑点。故从展开剂、显色剂方面进行改进。以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V／V／V），在 10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液[30]，并在60℃加热，置日光下检视[21]。供试品溶液色谱中点与点之间的分离度不够，斑点不够清晰，存在拖尾现象。故最终调整展开剂，同时选择引入浓氨水来解决拖尾问题，且适当控制点样的浓度和点样量，浓度过高易拖尾，过低斑点不明显。将浓度进行适当稀释，同时点的斑点小一些，且进行二次跑板以解决分离度的问题。在此过程中，还出现边缘效应问题，曾采用2种方法解决：点板尽量不要往薄层板边缘点；在饱和展开剂的过程中把通风橱关掉，尽量无风，同时保持低温，以减小边缘效应的出现。

鹿衔草的TLC鉴别中，最初选用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.5，V／V／V）上层溶液为展开剂，结果不理想，因此参照《中国药典》中展开剂的比例进行调整，最后选用甲苯 -甲酸乙酯 -甲酸（5∶4∶0.5，V／V／V）上层溶液为展开剂，展开结果良好，无干扰。需注意的是，对照品溶液用的是水晶兰苷，极易分解，不宜长时间放置，最好现配现用；点板用10 cm×10 cm的硅胶G板太小，存在边缘效应。故换用10 cm×20 cm的薄层板（划成10 cm×15 cm的薄层板备用），长边作为点板处，首尾距离边缘处稍远。

综上所述，相同药材在不同的中成药中TLC鉴别方法不一定通用，且单一味药和复方药中的同一种药材的鉴别方法也有差异，需根据具体情况分析，摸索和探究找出一种最适合的方法。