二黄益肾汤质量标准研究

田雪芬，郭文厂，李冬冬 ，黄秀贞

（山东省济宁市中医院，山东 济宁 272100）

二黄益肾汤系山东省济宁市中医院肾病科的临床经验方，由丹参、炒白术、大黄、炙淫羊藿等10味中药组方，具有补益脾肾、降浊排毒、活血通络之功效，用于气虚湿瘀型慢性肾功能不全（CKD 3～4期）的治疗。为确定其制备工艺的合理性，全面有效控制质量，保障临床用药安全、有效，本研究中采用薄层色谱（TLC）法对方中大黄和白术进行了定性鉴别，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定丹参中丹参素和原儿茶醛及淫羊藿中淫羊藿苷的含量，为进一步完善二黄益肾汤的质量标准提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB-135S型电子天平（Mettler Toledo公司，精度为十万分之一）；KQ-500DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为 300 W，频率为 25 kHz）；ZF-8型暗箱三用紫外分析仪（上海一科仪器有限公司）。

1.2 试药

大黄对照药材（批号为 120984-201202），白术对照药材（批号为120925-201611），丹参素钠对照品（纯度≥98%，批号为110855-201614），原儿茶醛对照品（纯度≥99%，批号为110810-201608），淫羊藿苷对照品（纯度≥98%，批号为110766-201721），均购自中国食品药品检定研究院；二黄益肾汤（济宁市中医院制剂室自制，批号分别为 20181217，20181219，20181221，规格为每瓶 150 mL）；甲醇，乙腈（色谱纯，Avantor Performance Materials，Inc.，USA；GC≥99.9% ）；娃哈哈纯净水；丹参（批号为201803201）、炒白术（批号为201804122）、大黄（批号为 201801291）、炙淫羊藿（批号为201803266）等10味药材均由济宁邦尔中药饮片有限公司提供，经济宁市中医院刘会芳副主任中药师鉴定为正品，均符合《中国药典(一部)》相关规定。

2 方法与结果

2.1 样品制备

按处方称取丹参、炒白术、大黄、炙淫羊藿等10味药材，其中炒白术、砂仁、莪术混合加10倍量水，浸泡0.5 h，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，冷藏备用；大黄加 12倍量水，浸泡 0.5 h，微沸 5 min，滤过，备用；其余6味药材与提取挥发油的药渣和蒸馏后的水溶液、大黄药渣混合，加 14倍量水，浸泡 0.5 h，煎煮 1 h，倾出煎液；药渣再加10倍量水，煎煮40 min，倾出煎液，合并2次煎液，滤过；将滤液浓缩至约350 mL，放冷至室温，搅拌下加入大黄滤液，冷藏、静置过夜，滤过，滤液加热至沸，放冷，加入上述挥发油，加纯化水至450 mL，混匀，即得样品。

2.2 薄层色谱鉴别

大黄：取样品（批号为 20181014）30 mL，加盐酸 2 mL，加热回流 30 min，立即冷却，用乙醚提取 2次，每次40 mL，合并乙醚液，溶剂挥干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。取大黄对照药材0.5 g，加甲醇20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。取除大黄外的其余药材，按处方和样品制备工艺制备不含大黄的阴性对照品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照药材溶液。照2015年版《中国药典(一部)》通则0502中 TLC法，吸取供试品溶液8 μL和对照药材溶液6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯 -甲酸（7.5∶2.5∶0.6，V／V／V）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏至斑点显色清晰[1-3]。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，置紫外光灯（365 nm）下检视，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图1。

图1 大黄薄层色谱图

白术：取样品（批号为 20181014）90 mL，加乙醚振摇提取2次，每次100 mL，合并乙醚液，溶剂挥干，残渣加环己烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取白术对照药材 2.0 g，加水 50 mL，加热回流 30 min，放冷，滤过，用乙醚提取2次，每次60 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加环己烷1 mL使溶解，作为对照药材溶液。取除白术外的其余药材，按处方和样品制备工艺制备不含白术的阴性对照品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照药材溶液。照 2015年版《中国药典(一部)》通则0502中 TLC法，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（2∶1，V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视[1，4]。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图2。

图2 白术薄层色谱图

2.3 丹参素和原儿茶醛含量测定

2.3.1 色谱条件[5-7]

色谱柱：Purospher star RP-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（流动相 A），0.4% 冰醋酸 - 水溶液（流动相 B），0～35 min 时 3% ～10% （A）；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL ／min；进样量：8 μL。

2.3.2 溶液制备

分别取丹参素钠对照品1.07 mg和原儿茶醛对照品0.27 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.097 6 g／L的丹参素对照品贮备液（1 mg丹参素钠相当于0.912 mg丹参素）和0.027 0 g／L的原儿茶醛对照品贮备液。按2.1项下方法制备样品，精密量取5 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，过滤，即得供试品溶液。

2.3.3 方法学考察

专属性试验：按处方和制备工艺制备不含丹参的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。分别精密吸取上述3种溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定。色谱图见图3。

线性关系考察：精密量取上述对照品贮备液，用甲醇逐级稀释成 6.1，12.2，24.4，48.8，73.2，97.6 μg ／mL系列质量浓度的丹参素对照品溶液和 1.688，3.375，6.750，13.500，20.250，27.000 μg ／mL 系列质量浓度的原儿茶醛对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液各16μL，按拟订色谱条件依法分别进样，记录峰面积。以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性拟合，得丹参素的回归方程 Y丹＝13 035.912 X丹-4 369.223，r＝1.000 0(n＝6)；原儿茶醛的回归方程 Y原＝71 310.237 X原-6 841.460，r＝1.000 0。结果表明，丹参素和原儿茶醛的质量浓度分别在 6.1 ～ 97.6 μg／mL，1.688 ～27.000 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

图3 丹参高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取上述对照品混合贮备液8 μL，按拟订色谱条件进样测定，连续进样6次。结果丹参素和原儿茶醛峰面积的 RSD分别为 0.96%和 1.40%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为20181219），精密吸取供试品溶液 10 μL，按拟订色谱条件分别于 0，4，8，12，16，24 h时进样测定。结果丹参素和原儿茶醛含量的RSD 分别为 2.67%和 2.08% （n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为20181219），依法制备供试品溶液6份，按拟订色谱条件进样测定，各进样1次。结果丹参素和原儿茶醛含量的 RSD分别为2.54%和1.21%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：平行取6份已知含量的样品（批号为20181219）45 mL，分为平行2份3个水平，分别加入含量相当量80%，100%，120%的丹参素和原儿茶醛混合对照品，依法制备供试品溶液，进样10 μL，记录色谱图，测量丹参素和原儿茶醛的峰面积，代入回归方程计算。结果丹参素的平均回收率为 99.58%，RSD为2.36% （n＝ 6）；原儿茶醛的平均回收率为 101.44% ，RSD 为 1.30%（n＝6）。

定量限、检测限确定：取上述对照品贮备液逐级稀释，取信噪比（S／N）为10的作为定量限，丹参素和原儿茶醛的定量限分别为 11.146，1.013 ng；取 S ／N 为 3的作为检测限，丹参素和原儿茶醛的检测限分别为1.793 ng 和 0.006 80 ng。

2.3.4 样品含量测定

取3批样品，按供试品溶液制备方法平行制备2份，按拟订色谱条件分别进样测定，计算样品中丹参素和原儿茶醛的含量。结果见表1。

表1 样品含量测定结果（mg／100 mL，n＝3）

2.4 淫羊藿苷含量测定

2.4.1 色谱条件[8-9]

色谱柱：Purospher Star RP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈 -0.1%磷酸溶液（26 ∶74，V／V）；流速：0.8 mL ／min；检测波长：269 nm；进样量：8 μL。

2.4.2 溶液制备

取淫羊藿苷对照品 1.29 mg，精密称定，置 10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.129 g／L的淫羊藿苷对照品贮备液。精密吸取样品（批号为20181217）5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，超声处理（功率为 300 W，频率 25 kHz） 20 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，续滤液浓缩至5 mL，即得供试品溶液。

2.4.3 方法学考察

专属性试验：按处方和制备工艺制备不含淫羊藿的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。分别精密吸取上述3种溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定。色谱图见图4。

线性关系考察：精密量取上述对照品贮备液，用甲醇逐级稀释成 8.063，16.125，32.250，64.500，96.750，129.000 μg／mL系列质量浓度的对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液各16 μL，按拟订色谱条件及方法分别进样，记录峰面积。以对照品溶液质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性拟合，得淫羊藿苷的回 归 方 程 Y＝33 267.217X+10 163.538， r＝1.000 0(n＝6)。结果表明，淫羊藿苷质量浓度在 8.063～129.000 μg ／mL 范围内线性关系良好。

精密度试验：精密吸取上述对照品贮备液10 μL，按拟订色谱条件连续进样6次，记录淫羊藿苷的峰面积。结果的 RSD为0.48%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为20181217），依法制备供试品溶液，精密吸取5 μL，按拟订色谱条件分别于0，4，8，12，16，24 h 时进样测定。结果淫羊藿苷含量的RSD为2.49%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为20181217），依法制备供试品溶液6份，按拟订色谱条件进样测定。结果淫羊藿苷含量的 RSD为 1.84%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：平行取6份已知含量的样品各10mL，分为平行2份3个水平，分别加入含量相当量80%，100%，120%的淫羊藿苷对照品粉末，依法制备供试品溶液，每次进样5 μL，记录色谱图，测量淫羊藿苷的峰面积，代入回归方程计算。结果淫羊藿苷的平均回收率为 99.80%，RSD 为 1.08%（n＝6）。

定量限、检测限确定：取上述对照品贮备液逐级稀释，取信噪比（S／N）为10的作为定量限，淫羊藿苷的定量限为 1.954 ng；取 S／N为 3的作为检测限，淫羊藿苷的检测限为0.279 ng。

2.4.4 样品含量测定

取3批（批号分别为20181217，20181219，20181221）样品，依法平行制备2份供试品溶液，按拟订色谱条件分别进样测定，计算含量。结果见表1。

图4 淫羊藿高效液相色谱图

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别要求

对白术进行薄层色谱鉴别时，105℃加热至紫外灯下检视，主斑点不清晰，105℃加热时间略长，但羧甲基纤维素未碳化变黑后，主斑点显色清晰。对大黄进行薄层鉴别时，参考2015年版《中国药典(一部)》中八正合剂相应药材的鉴别方法，方法简单、合理，斑点显色清晰，分离效果好。

3.2 丹参中有效成分含量分析指标确定

丹参中有效成分主要为脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类化合物，2015年版《中国药典(一部)》规定了丹参的含量测定成分为丹参酮类和丹酚酸B。丹参酮类化合物具有脂溶性高、对光和温度不稳定、半衰期短等缺点。GONG等[10]报道了丹酚酸B受热后降解为丹酚酸A、咖啡酸、丹酚酸C、丹参素、原儿茶醛等，其降解产物可作为以丹酚酸B为指标进行含量分析的物质基础。原儿茶醛具有抗氧化、抑制血小板聚集、改善肾脏血循环、减轻急性肾损伤引起的肾小管坏死的作用[11]；丹参素可降低肾小管上皮细胞转分化为成纤维细胞的比率，维持肾小管上皮细胞的正常形态[12]。对含有丹参的中药复方制剂进行含量测定时，多以丹参素和原儿茶醛作为指标[13]。故本试验中选择了丹参中的2种水溶性成分（丹参素和原儿茶醛）为指标进行含量分析。

3.3 流动相选择

流动相采用了甲醇（B）-0.4%冰醋酸水溶液（C）等度洗脱[14]，结果发现峰形拖尾较严重，样品中化合物的峰高被压得很低。选择流动相乙腈（B）-0.4%冰醋酸水溶液（C）梯度洗脱，0～7 min时 2% ～5%（B），7～35 min 时5% ～13%（B）[5]，但原儿茶醛与其前面一个未知峰未分开。经多次调整梯度洗脱的流动相比例，但峰形越来越无法分开，因此减少梯度洗脱比例变化的幅度，采用乙腈（B）-0.4% 冰醋酸水溶液（C）梯度洗脱，0～40 min时 3% ～9% （B）、0～35 min 时 3% ～11% （B），前者出峰时间较长，后者原儿茶醛与其前面一个峰相邻太近。最后采用0～35 min时3% ～10%（B）的比例，则丹参素和原儿茶醛可完全与杂峰分离，且峰形和出峰时间较好。

3.4 淫羊藿流动相和检测波长选择

淫羊藿中多以淫羊藿苷为指标进行含量测定[15-16]。曾考察乙腈 -水（25∶75，26∶74，28∶72，30∶70，V／V)，其中流动相比例为25∶75时出峰时间太长，为28∶72和30∶70时基线不稳，为26∶74时样品分离度良好，略有拖尾。故确定用乙腈 -0.1% 磷酸水溶液（26∶74，V／V）作为淫羊藿苷的流动相。使用二极管阵列检测器（PDA）进行了全波长扫描（190～800 nm），结果淫羊藿样品在269 nm波长处淫羊藿苷有较大吸收，且杂质成分干扰少，故选择269 nm作为淫羊藿苷的检测波长。