慢性高原病患者血浆组织因子微粒和P-选择素与凝血功能异常的关系研究

王卓亚，杨发满，周红梅，刘冀，汪元浚，李晓平，敬泽慧

本研究价值：

（1）本研究发现了慢性高原病患者血浆组织因子微粒（TF-MPs）和P-选择素与血栓形成有一定的相关性，并且为慢性高原病患者血栓形成的独立危险因素，为临床预防和评估血栓形成找到了新的观测指标。

（2）本研究发现TF-MPs和P-选择素与慢性高原病的血栓形成有关，但未进一步发现其机制，仅为相关性研究，希望在以后的研究中进一步探索。

慢性高原病（CMS）患者由于长期高原缺氧，红细胞代偿增加，血液黏稠呈高凝状态［1］。组织因子（TF）作为体内外源性凝血途径的启动因子，可以存在于细胞微粒表面形成组织因子微粒（TF-MPs），其表面的磷脂酰丝氨酸（PS）和TF具有很强的促凝活性。研究发现P-选择素是血小板活化的标志物［2］，P-选择素可能是深静脉血栓的一个重要危险因素［3］。本研究旨在了解CMS凝血功能异常和血浆TF-MPs、P-选择素的相关性，为临床提供更多资料。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年12月—2018年9月入住青海大学附属医院的CMS并深静脉血栓患者20例为CMS并血栓组（CMS+T组）、CMS患者40例为CMS组。CMS+T组纳入标准：CMS标准符合第六届国际高原医学和低氧生理学术大会颁布的慢性高原病青海诊断标准［4］；世居或移居（时间≥2年）海拔2 500 m以上的汉族男性患者；下肢静脉CT血管造影（CTA）确诊为深静脉血栓。CMS+T组排除标准：肺动脉CTA确诊为肺栓塞；真性红细胞增多症；骨髓增殖性疾病；由于肺部疾患及睡眠障碍导致的继发性红细胞增多症；近3个月使用影响凝血功能及血小板功能药物；心功能不全；肝、肾功能障碍；自身免疫性疾病等炎性疾病；合并有其他慢性疾病如高血压、糖尿病；恶性肿瘤者。CMS组纳入标准仅为CMS+T组纳入标准的第一项和第二项。CMS组排除标准：深静脉血栓；余同CMS+T组排除标准。CMS+T组患者平均年龄（46.0±8.6）岁，平均居住海拔（3 216.5±332.8）m；CMS组患者平均年龄（45.6±9.3）岁，平均居住海拔（3 387.5±413.1）m。

另选取同期于本院进行健康体检的高原体检健康者28例为高原健康对照组（GY组），于运城市中心医院的平原体检健康者40例为平原健康对照组（PY组）。GY组纳入标准：世居或移居（时间≥2年）海拔2 500 m以上的健康汉族男性。PY组纳入标准：世居或移居（时间≥2年）海拔500 m以下的健康汉族男性。GY组人群平均年龄（43.8±11.1）岁，平均居住海拔（3 228.5±314.6）m；PY组人群平均年龄（46.0±10.3）岁，平均居住海拔（419.4±282.8）m。

4组年龄比较，差异无统计学意义（F=0.146，P=0.932）；4组居住海拔比较，差异有统计学意义（F=590.736，P＜0.001）；其中CMS+T组、CMS组、GY组居住海拔均高于PY组，差异均有统计学意义（P＜0.001）。

本研究经青海大学附属医院伦理委员会通过，所有患者及健康者已签署书面同意书。

1.2 血常规及凝血指标的测定 抽取所有受检者治疗前空腹静脉血2 ml置于EDTA管中，应用全自动血细胞分析仪SYSMEXXE-2100测定血红蛋白（Hb）、血小板计数（PLT）；抽取GY组和PY组空腹静脉血2 ml、CMS组和CMS+T组空腹静脉血3.6 ml置于柠檬酸钠管中，采用全自动凝血功能仪SYSMEX-CA7000测定凝血酶原时间（PT）、部分凝血酶原时间（APTT）、D-二聚体，具体操作过程按仪器操作规范和配套试剂说明书进行。

1.3 TF-MPs测定 抽取受检者治疗前空腹静脉血5 ml，置于EP管中，以160×g离心20 min，获取富血小板血浆，吸取上层2/3血浆，以1 000×g离心20 min，取上清获得乏血小板血浆。将异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗Annexin Ⅴ抗体（美国BD公司）和藻红蛋白（PE）标记的抗CD142抗体（美国BioLegend公司）或等量的同型对照抗体加入50 μl乏血小板血浆中，室温孵育30 min，随后加入1 ml磷酸盐缓冲溶液（PBS）后采用流式细胞仪（美国BD公司-FACSCantoⅡ）检测，标本上机前用0.1～1.0 μm的标准进行前向角设门，门内收集的微粒进行FITC和PE荧光强度分析。TF-MPs定义为直径0.1～1.0 μm且CD142+/Annexin Ⅴ+的微粒。

1.4 P-选择素测定 抽取所有受检者治疗前空腹静脉血 5 ml，以 1 000×g 离心 10 min，取血浆放于 EP 管中，用P-选择素试剂盒（上海远慕生物科技有限公司）进行测定。

1.5 观察指标 比较PY组、GY组，CMS+T组、CMS组、GY组Hb、PLT、凝血功能（PT、APTT、D-二聚体）、TF-MPs、P-选择素，分析CMS患者TF-MPs、P-选择素、D-二聚体、PLT间的相关性及患者发生深静脉血栓的影响因素，并探究D-二聚体、TF-MPs、P-选择素预测CMS患者发生深静脉血栓的价值。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，两组间比较采用成组t检验；两个变量间的相关性分析采用Pearson相关分析；影响因素分析采用多因素Logistic回归分析；绘制D-二聚体、TF-MPs、P-选择素预测CMS患者发生深静脉血栓的受试者工作特征（ROC）曲线，并计算ROC曲线下面积（AUC）、灵敏度、特异度等。双侧检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 PY组、GY组Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-选择素比较 GY组Hb、P-选择素高于PY组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组PLT、PT、APTT、D-二聚体、TF-MPs比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

2.2 CMS+T组、CMS组、GY组Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-选择素比较 CMS+T组、CMS组、GY组Hb、PLT、PT、APTT、D-二聚体、TF-MPs、P-选择素比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中CMS+T组、CMS组Hb高于GY组，PLT低于GY组，PT、APTT长于GY组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CMS+T组D-二聚体水平高于CMS组、GY组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CMS组、CMS+T组 TF-MPs、P-选 择素高于GY组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CMS+T组TF-MPs、P-选择素高于CMS组，差异有统计学意义（P＜0.05）；余指标组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

2.3 CMS患者TF-MPs、P-选择素、PLT、D-二聚体相关性分析 CMS患者TF-MPs、P-选择素、PLT、D-二聚体分别为（1.41±0.45）%、（7.74±2.68）ng/L、（120.0±51.5）×109/L、（2.94±1.93）mg/L， 其 中TF-MPs与P-选择素呈正相关（r=0.589，P＜0.001），与PLT呈负相关（r=-0.451，P=0.008），与D-二聚体无直线相关关系（r=0.228，P=0.080）；P-选择素与PLT呈负相关（r=-0.442，P＜0.001），与D-二聚体无直线相关关系（r=0.070，P=0.560）。

2.4 CMS患者发生深静脉血栓的影响因素分析 以CMS是否发生深静脉血栓为因变量（赋值：未发生=0，发生 =1），以Hb、PLT、PT、APTT、TF-MPs、P-选择素为自变量（赋值见表3），进行多因素Logistic回归分析，结果显示，PT、TF-MPs、P-选择素是CMS患者发生深静脉血栓的影响因素（P＜0.05，见表4）。

表1 PY组、GY组Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-选择素比较（±s）Table 1 Comparison of Hb，PLT，coagulation function parameters，TF-MPs and P-selectin between PY and GY groups

表1 PY组、GY组Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-选择素比较（±s）Table 1 Comparison of Hb，PLT，coagulation function parameters，TF-MPs and P-selectin between PY and GY groups

注：Hb=血红蛋白，PLT=血小板计数，PT=凝血酶原时间，APTT=部分凝血酶原时间，TF-MPs=组织因子微粒；PY组=平原健康对照组，GY组=高原健康对照组

组别 例数 Hb（g/L） PLT（×109/L） PT（s） APTT（s） D-二聚体（mg/L） TF-MPs（%） P-选择素（ng/L）PY 组 40 148.9±13.2 203.3±45.7 11.4±1.0 29.6±7.1 0.67±0.33 0.55±0.29 2.28±0.75 GY 组 28 163.7±17.7 179.0±56.6 11.4±0.8 29.8±3.8 0.70±0.27 0.64±0.23 2.81±1.17 t值 3.950 -1.960 0.072 0.123 0.438 1.345 2.271 P值 ＜0.001 0.054 0.943 0.903 0.663 0.183 0.026

表2 CMS+T组、CMS组、GY组Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-选择素比较（±s）Table 2 Comparison of Hb，PLT，coagulation function parameters，TF-MPs and P-selectin among CMS+T，CMS and GY groups

表2 CMS+T组、CMS组、GY组Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-选择素比较（±s）Table 2 Comparison of Hb，PLT，coagulation function parameters，TF-MPs and P-selectin among CMS+T，CMS and GY groups

注：CMS=慢性高原病；CMS+T组=CMS并血栓组；与GY组比较，aP＜0.05；与CMS组比较，bP＜0.05

组别 例数 Hb（g/L） PLT（×109/L） PT（s） APTT（s） D-二聚体（mg/L） TF-MPs（%） P-选择素（ng/L）GY 组 28 163.7±7.8 182.5±54.7 11.4±0.8 29.8±3.8 0.73±0.27 0.64±0.23 2.81±1.17 CMS 组 40 225.4±16.1a 123.0±47.4a 17.9±4.9a 43.0±10.3a 1.14±0.96 1.28±0.42a 6.96±2.21a CMS+T 组 20 221.5±11.5a 114.2±59.6a 15.3±4.4a 41.0±11.1a 6.55±4.28ab 1.65±0.42ab 9.30±2.91ab F值 315.300 13.628 22.862 18.942 19.771 46.956 58.972 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 CMS患者发生深静脉血栓影响因素的多因素Logistic回归分析赋值表Table 3 Assignment table of factors associated with deep vein thrombosis in CMS patients incorporated in the multivariate Logistic regression model

表4 CMS患者发生深静脉血栓影响因素的多因素Logistic回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of factors influencing deep vein thrombosis in CMS patients

表5 D-二聚体、TF-MPs、P-选择素预测CMS患者发生深静脉血栓的AUC、约登指数、最佳截断值、灵敏度、特异度Table 5 AUC，Youden's index，optimal cutoff value，sensitivity and specificity of D-dimer，TF-MPs and P-selectin in predicting deep vein thrombosis in CMS patients

2.5 分析D-二聚体、TF-MPs、P-选择素预测CMS患者发生深静脉血栓的价值 绘制D-二聚体、TF-MPs、P-选择素预测CMS患者发生深静脉血栓的ROC曲线，结果显示，D-二聚体、TF-MPs、P-选择素预测CMS患者发生深静脉血栓的AUC分别为0.939、0.727、0.732，灵敏度分别为85.0%、45.0%、70.0%，特异度分别为92.5%、87.5%、75.0%（见图1、表5）。

图1 D-二聚体、TF-MPs、P-选择素预测CMS患者发生深静脉血栓的ROC曲线Figure 1 ROC curve of D-dimer，TF-MPs，and P-selectin for predicting deep vein thrombosis in CMS patients

3 讨论

微粒是一种直径为0.1～1.0 μm的脂蛋白，为血小板、白细胞、上皮细胞和平滑肌细胞等在激活或凋亡过程中从细胞膜上脱落下来的片段，需要与直径＞1.0 μm的血小板和直径＜0.1 μm的外来杂质相鉴别［5-6］。微粒在脂质双分子层中表达负电荷的PS，可为凝血过程提供必需的负离子脂质表面。TF是外源性凝血途径的启动因子，既往认为只有当血管壁的完整性遭到破坏时TF才暴露于循环血液，通过激活凝血级联反应发挥止血作用，但近来有研究表明TF不仅表达于各种组织表面和血管外膜，还存在于循环血液中［7］。TF以微粒为载体共同构成TF-MPs，其可与丝氨酸蛋白酶因子Ⅶ／Ⅶa结合形成双分子复合物，并在Ⅷ因子的作用下激活Ⅹ因子转变成Xa，使凝血酶原变成凝血酶，在血栓形成过程中发挥重要作用［6-7］。

本研究发现，TF-MPs在GY组、CMS组、CMS+T组中依次升高，提示TF-MPs与CMS和CMS并深静脉血栓有一定的相关性。分析其机制可能与以下因素有关：CMS患者长期缺氧导致广泛内皮系统受损［8］，表现为血管内皮屏障作用减弱，信息传递及分泌能力下降，扩血管物质自分泌能力下降，缩血管物质相对增加，白细胞黏附及血小板聚集度增强［9］，而微粒的产生主要来源于激活的血小板、白细胞、上皮细胞和平滑肌细胞，CMS由于慢性缺氧损伤了血管内皮，刺激了上述微粒的生成。本课题组同时发现，CMS患者内皮细胞微粒水平升高［10］，也证明了这种推测。生理情况下TF是被加密的，只有在特定条件下被解密，从而表达促凝活性［11］。CMS患者血浆TF-MPs水平升高，推测该疾病可能导致TF解密，具体机制有待进一步研究。本研究中发现CMS+T组TF-MPs水平最高，考虑TF-MPs参与了CMS患者深静脉血栓的形成。

P-选择素由活化的血小板释放，是血小板活化或血栓形成的特异性标志物，可以反映凝血功能亢进状态下血小板的激活情况［5］，其释放与PLT活化和内皮细胞受损有关［3］。P-选择素可与配体相结合进一步介导活化的PLT、内皮细胞与白细胞的黏附，促进血栓的形成［12］。SHANG等［13］研究发现在高海拔地区居住时间＞2个月者血小板呈活化状态，其P-选择素明显升高，考虑血小板活化与高原低氧有关。在本研究中发现PY组Hb、P-选择素低于GY组，说明在高原低氧情况下，人体Hb呈代偿性增生，同时由于高原低氧，P-选择素升高提示血小板呈活化状态。一般认为，血液中P-选择素基础水平主要来源于血小板，而在疾病状态下，高水平的P-选择素水平主要由活化的内皮细胞分泌所致，同时多种炎性递质可通过不同的机制增强人内皮细胞P-选择素mRNA和蛋白质持续性转录合成［14］。而本课题组发现，CMS患者内皮细胞微粒水平升高，提示内皮受损处于活化状态［10］。而多项研究证实CMS是由于内皮受损、炎性递质水平升高等因素共同导致了CMS患者P-选择素水平升高［15］。P-选择素在活化的血小板表面融合并大量表达，介导血管内皮细胞最终参与血栓形成［7］，因此P-选择素在CMS+T组最高，在CMS组、GY组和PY组依次降低。由此，笔者考虑TF-MPs、P-选择素参与了CMS患者深静脉血栓形成的过程。

既往研究证实，在损伤修复、实体瘤和恶性血液病中，大量的TF-MPs聚集在血小板表面形成血栓，并且该过程依赖于P-选择素和P-选择素配体的相互作用［16-18］，这与本研究相符，CMS患者TF-MPs、P-选择素呈正相关。而P-选择素作为中性粒细胞及单核细胞的受体，使血小板与中性粒细胞黏附聚集，形成血栓，从而血小板被活化后消耗增多，破坏加速，这与国内吴纯［19］的研究结果相一致。因此血小板活化后的消耗性破坏是CMS患者PLT降低的一个重要原因，故在CMS患者中TF-MPs、P-选择素与PLT呈负相关。

本研究及既往研究均发现，CMS患者PT、APTT延长，出血风险升高，但由于长期高原低氧，红细胞代偿增加，血液黏稠呈高凝状态，血栓发生率也同时增高，甚至有些患者会出现血栓栓塞性疾病合并凝血功能异常，目前临床上采用凝血功能指标（PT、APTT）等进行出血预测，进而提早干预，但在干预出血的同时如果能够结合高凝和血栓形成的预测指标进行判断，将会对临床治疗起到积极作用。目前临床常用的指标为D-二聚体，依据的是已经形成血栓后在纤溶酶作用下分解后产生的物质，可以说其是血栓形成和继发纤溶的结果，而不是在血栓或高凝状态形成之初的物质，而血浆TFMPs、P-选择素参与了血栓的形成，可能是血栓形成的重要物质。笔者通过多因素Logistic回归分析发现，TF-MPs、P-选择素是CMS患者发生深静脉血栓的独立危险因素，PT是CMS预防发生深静脉血栓的保护因素，故临床上可以通过检测这些指标从而进行风险判定，后续将继续研究是否可以通过吸氧、降低血细胞比容、保护血管内皮等治疗降低该指标，以期减少CMS患者发生血栓的风险。

国外学者研究显示，CMS患者PLT较健康人群明显降低，同时CMS患者是血栓栓塞性疾病的高危人群［20-21］，CMS患者在PLT减少的情况下仍表现高凝状态，临床很少发现明显的出血倾向［22］，推测血小板功能为活化状态。本研究结果证明在高原低氧的情况下，血小板仍处于活化状态，且CMS中血小板活化水平更高，这可能是CMS发生深静脉血栓的一个因素；同时CMS患者血浆TF-MPs水平升高，其可为血栓形成提供PS及TF，促进血栓形成。在本研究中，CMS患者P-选择素、TF-MPs与PLT呈负相关，说明血栓发生风险与PLT密切相关，血小板活化后的消耗性破坏可能是CMS患者PLT降低的一个重要原因。通过ROC曲线分析发现，D-二聚体、TF-MPs和P-选择素评估CMS患者发生深静脉血栓的灵敏度和特异度均较高，这将对CMS患者抗凝和血栓的治疗起到指导作用。

综上所述，长期居住在高原可引起Hb和PLT降低，且CMS患者TF-MPs、P-选择素与PLT降低和深静脉血栓形成有一定关系，同时PT、TF-MPs、P-选择素是CMS患者发生深静脉血栓的影响因素，D-二聚体、TF-MPs、P-选择素预测CMS患者发生深静脉血栓有一定价值。

志谢：感谢运城市中心医院同仁收集并提供资料。

作者贡献：王卓亚进行文章的构思与设计、研究的实施与可行性分析、结果分析与解释、撰写论文和论文修订；杨发满进行研究的实施与可行性分析、负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责并监督管理；周红梅、敬泽慧进行数据收集；汪元浚、李晓平进行数据整理；刘冀进行统计学分析。

本文无利益冲突。