基于TCGA数据库分析CCDC34基因在肝细胞癌中的表达及意义

向晓辉， 毛 骏， 李 海

1 天津市西青医院 消化内科， 天津 300380； 2 天津市肝脏胰腺纤维化与分子诊疗重点实验室， 天津 300162；3.武警后勤学院， 天津 300309

肝细胞癌作为常见的消化系统恶性肿瘤之一，多数患者早期可无任何症状，少数可出现腹痛、发烧、嗜睡等症状，临床表现集中发生在疾病的晚期[1-2]。全球仅2018年统计新发病例达84.1万例，死亡78.2万例，且易患人群呈年轻化趋势[3]。目前临床上肝细胞癌患者的远期生存率不甚理想，其高病死率很大程度上与肿瘤确诊时间晚、转移发生早相关[4-5]。卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain-containing protein，CCDC)蛋白家族是一种由两个或两个以上的卷曲螺旋结构域组成的同寡聚体或寡聚体序列蛋白，可通过基因转录、介导细胞凋亡、调控细胞周期等多种途径参与肿瘤的发生发展过程[6]。近年来越来越多研究[7-10]发现，CCDC蛋白在甲状腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。蛋白家族成员CCDC34又称为肾脏癌抗原NY-REN-41，由373个氨基酸组成，位于11p14.1染色体[11]。目前，CCDC34基因与肝细胞癌的相关性研究尚不深入，本研究拟基于癌症基因组图集(the cancer genome atlas，TCGA)数据库探讨CCDC34基因在肝细胞癌组织中的表达情况及其临床意义，以期为肝细胞癌提供新的诊断标志物和治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 数据来源 自 TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)下载了374例肝细胞癌组织样本和50例癌旁组织样本的mRNA表达谱及临床数据，其中370例患者具有匹配的mRNA表达谱和生存数据。

1.2 数据处理与患者分组 下载edge R软件包(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/e

dgeR.html),对mRNA原始数据进行基于加权截尾均值化M值标准化处理，并经log2转换后用于后续分析[12-13]。基于肝细胞癌患者CCDC34基因表达谱和随访数据，根据X-tile 3.6.1软件 (Yale University School of Medicine，New Haven，CT，USA)确立最佳分组截断值。取最佳截断值9.30将其分为高表达组(90例)和低表达组(280例)。

1.3 基因集富集分析 使用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)软件研究CCDC34基因表达水平与京都基因和基因组百科全书通路基因集的相关性[14-16]。根据CCDC34基因的表达水平建立连续表型，按默认加权富集统计(default weighted enrichment statistic)的方法计算CCDC34基因与参照基因集的Pearson相关系数，并按照相关系数大小进行基因排序。设置随机组合次数为1000次，计算富集系数(enrichment score，ES)和标准化后的富集系数(normallized enrichment score，NES)，以标准化P<0.01且错误发现率(false discovery rates，FDR)<0.05为显著性富集。

2 结果

2.1 CCDC34基因在癌组织和癌旁组织中的差异表达 在TCGA库中，CCDC34基因在患者癌组织和癌旁组织的表达水平分别为8.732±0.987和7.236±0.647，差异有统计学意义(t=-14.261，P<0.001)；在同一患者的癌组织和癌旁组织的表达水平分别为8.853±1.008和7.236±0.647，差异亦有统计学意义(t=-11.194，P<0.001)(图1)。

注：a，TCGA库肝细胞癌患者癌组织和癌旁组织中CCDC34基因的差异表达；b，同一患者癌组织和癌旁组织中CCDC34基因的差异表达。

图1CCDC34基因在患者癌组织和癌旁组织中的表达水平

2.2 肿瘤组织中CCDC34基因表达水平与临床病理指标的关系 对TCGA库中数据统计列表分析，CCDC34基因的表达水平在TNM分期和肿瘤分级之间差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而在患者年龄、性别、有无肝纤维化和有无血管浸润等指标之间差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表1)。

2.3 CCDC34基因与肝细胞癌患者预后的相关性 CCDC34基因高表达患者总生存期显著低于低表达患者(χ2=21.716，P<0.001)，提示CCDC34基因高表达在肝细胞癌中是一项预后不良的因素(图2)。单因素Cox回归分析提示，CCDC34基因表达水平和TNM分期与肝细胞癌患者总生存期有关(P值均<0.001)。多因素Cox回归分析进一步提示，上述两项指标是影响肝细胞癌患者总生存期的独立危险因素(P值均<0.05)(表2)。

表1 CCDC34基因表达水平与肝细胞癌患者临床病理指标的关系

风险人数

高表达n=90n=20n=7n=0n=0

低表达n=280n=89n=35n=9n=1

图2CCDC34基因表达水平和肝细胞癌患者生存时间的关系

2.4 CCDC34基因功能富集分析 在TCGA库中的数据分析显示，CCDC34基因高表达样本富集到碱基切除修复、剪接体、核苷酸切除修复、嘧啶代谢、DNA复制、同源重组、细胞周期、错配修复等8个相关通路基因集(P<0.01，FDR<0.05)，提示CCDC34基因可能通过上述通路发挥促进肿瘤发生发展的作用(表3，图3)。

表3 CCDC34基因正相关的肝细胞癌样本富集的通路基因集

3 讨论

近年来越来越多的研究开始关注CCDC蛋白家族在肿瘤中的作用，研究报道CCDC蛋白的表达异常可能通过调节细胞骨架的重排，从而促进肿瘤细胞的运动与迁移[17-18]。CCDC34蛋白作为CCDC蛋白家族中的一员，其在肿瘤中的潜在临床价值也被日益重视。Geng等[19]报道CCDC34蛋白可能通过抑制癌细胞的凋亡和促进侵袭来促进结直肠癌的发生发展。另有研究[20]证实，CCDC34蛋白在食管鳞癌中过表达，其与肿瘤进展、血管生成和不良的存活率有关，并且可用作指示患者预后不良的独立参数。探讨CCDC34基因与肝细胞癌预后的相关性及其临床价值无疑将有利于肝细胞癌的个体化诊断，从而为临床提供潜在的新治疗靶点。

本研究着重探讨CCDC34基因与肝细胞癌的相关性及其临床价值，借助TCGA数据库CCDC34基因 mRNA表达谱证实，CCDC34基因在肝细胞癌组织中mRNA表达水平较癌旁肝组织呈现上调，表明CCDC34基因具备作为肝细胞癌病理诊断标志物的潜在价值。结合TCGA数据库肝细胞癌患者的临床数据，本研究进一步分析了CCDC34基因表达水平与肝细胞癌患者预后的相关性，发现CCDC34基因表达水平与TNM分期和肿瘤分级相关。Kaplan-Meier生存分析显示，CCDC34基因高表达患者总生存期显著低于低表达患者，多因素Cox回归分析结果表明，CCDC34基因表达水平是影响肝细胞癌患者总生存期的独立危险因素，提示该基因有望成为肝细胞癌肿瘤诊断和患者预后判断的新型分子标志物。借助基因集富集分析，本研究发现CCDC34基因高表达组显著富集于碱基切除修复、剪接体等8条信号通路。细胞增殖能力是评价肿瘤细胞恶性程度的重要指标之一，肿瘤细胞通过周期性的有丝分裂不断增殖。在细胞周期的间期，细胞核苷酸嘧啶代谢增强，合成DNA复制所需的各种前体物和酶分子，从而完成DNA复制[21]。Gong等[22]发现CCDC34蛋白在膀胱癌组织和细胞系中表达升高，通过慢病毒介导的siRNA抑制其表达可以显著抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移，诱导细胞周期停滞在G2/M期并增加体外细胞的凋亡。结合GSEA结果，笔者推测CCDC34基因可能通过促进嘧啶代谢、DNA复制等方式调控细胞周期，增强癌细胞的增殖能力。当前，放疗和化疗仍是治疗肝癌的主要手段，其本质是通过造成DNA损伤以诱导癌细胞死亡。肿瘤细胞的DNA修复途径主要包括错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、跨损伤合成和同源重组等，其修复能力越强，放疗化疗抵抗往往越强。CCDC34基因可能通过增强肝癌细胞错配修复、碱基切除修复等能力，提高肝癌细胞对放化疗损伤的耐受性[23-25]。通过对血液系统肿瘤的研究发现，剪接体突变可以通过干扰姐妹染色单体的聚集，影响染色体稳定性、DNA修复和基因调节而最终导致肿瘤的发生[26]。虽然本研究为深入探讨CCDC34基因在肝细胞癌中的作用提供了线索和依据，但是肿瘤的发生发展是一个由多基因协同进行的复杂调控过程，CCDC34基因通过上述通路参与肝细胞癌发展的具体机制仍有待后续研究予以进一步阐明。

表2 影响肝细胞癌患者预后的单因素和多因素分析

注：a，富集碱基切除修复通路基因集；b，富集剪接体通路基因集；c，富集核苷酸切除修复通路基因集；d，富集嘧啶代谢通路基因集；e，富集DNA复制通路基因集；f，富集同源重组通路基因集；g，富集细胞周期通路基因集；h，富集错配修复通路基因集。

综上所述，本研究通过运用相关生物信息学方法揭示了CCDC34基因作为促癌基因参与肝细胞癌的发生发展过程，有助于改善肝细胞癌患者治疗后复发的监测策略，从而为临床上早诊断早治疗提供了新的思路。