外周血单个淋巴细胞遗传分析及其在遗传性疾病诊断中的应用*

2020-06-15严爱贞林炎鸿王志红兰风华

国际检验医学杂志 2020年11期

李丹，邱萍，严爱贞，林炎鸿，曾健，王志红，兰风华

(厦门大学附属东方医院全军检验医学研究所临床遗传与实验医学科，福建福州 350025)

单细胞研究于生物医学研究领域有着重要的意义，其被列为未来最值得关注的研究领域之一。单细胞分离是实现单细胞研究的基础，现有的分离技术有荧光激活细胞分选法、激光捕获显微切割、免疫磁珠法、微流控技术、连续稀释分离法、显微操作分离法等[1-2]。荧光激活细胞分选法、激光捕获显微切割、微流控技术等需依赖特殊的仪器，分选费用高，难以普及；连续稀释分离法操作简单，但大量存在的空白孔和多细胞孔需要研究人员观察排除，费时费力。本研究结合稀释法及体视镜下可视化显微操作，意在建立快速、简易、准确的单细胞分离技术，并采用基于多重退火环状循环扩增技术(MALBAC)[3]，旨在获得高覆盖度的单细胞全基因组扩增(WGA)产物，实现遗传性疾病的诊断。

1 材料与方法

1.1材料经厦门大学附属东方医院门诊收集11例体检健康者，β-珠蛋白生成障碍性贫血(β41-42M/βN型杂合突变个体)、法布里病(GLA基因第601位碱基由T突变为G，杂合突变个体)、先天性肾病综合征(NPHS1基因第274位碱基由G突变为A，杂合突变个体)携带者(各1例，每例后续均进行3次单细胞WGA)乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝新鲜外周血。

1.2仪器与试剂仪器：自制单细胞分离装置；体视镜(Leica)；细胞培养皿(BD Falcon)；PCR反应仪(珠海黑马)；凝胶电泳仪、凝胶成像分析仪(北京六一)；台式高速冷冻离心机(珠海黑马)。试剂:淋巴细胞分离液(Axi-shield)；单细胞WGA试剂盒(江苏亿康)；PCR-反向点杂交试剂盒(亚能生物)；rTaq DNA聚合酶(Takara)。

1.3方法

1.3.1外周血淋巴细胞分离外周血、PBS缓冲液等体积(均约2 mL，实验所涉及的PBS不含Mg2+、Ca2+)混匀加入含3 mL淋巴细胞分离液于离心管内，2 000 r/min 20 ℃水平离心20 min，吸取分离液与血浆间的白膜层；吸取液内加入5 mL PBS缓冲液混匀，1 500 r/min 20 ℃水平离心10 min，弃上清液；加入2 mL红细胞裂解液孵育5 min，500×g离心5 min，弃裂解液；加入5 mL PBS缓冲液，1 200 r/min 20 ℃离心10 min，弃上清液，重复操作1次；加入1 mL PBS缓冲液重悬，分离前后分别制备细胞涂片评估分离效果。

1.3.2单个淋巴细胞分离细胞培养皿上加1 μL细胞重悬液，补PBS形成体积约7 μL的液滴。连于自制单细胞分离装置的移液器，量程调至60 μL，在体视镜下自液滴吸取100～200个细胞打至培养板空白位置，补PBS形成7 μL新液滴；自新液滴吸取10～50个细胞，打至新的位置并补加PBS，如此反复至每个体视镜80倍视野仅可见2～3个细胞；将移液器量程调至30 μL，在镜下缓慢吸取单个细胞，吸取到单个细胞后轻推可见单细胞从针口跳出，将单细胞吸回直接打入灭菌PCR反应管。

1.3.3单细胞WGA 采用亿康MALBAC单细胞WGA试剂盒，严格按照说明书步骤操作，产物初定量及琼脂糖凝胶电泳后行后续扩增。

1.3.4一代测序检测目的基因比较WGA产物及对应外周血DNA目的基因一代测序结果，探讨本研究对遗传疾病诊断的价值。所涉及的引物见表1。

表1 目的基因扩增所用引物序列

PCR体系如下：10×缓冲液2.5 μL，2.5 μmoL dNTP 0.8 μL，rTaq酶0.2 μL，模板1 μL，纯水19.5 μL。反应条件：(1)变性95 ℃ 3 min。(2)扩增95 ℃ 30 s，相应的退火温度30 s，72 ℃ 1 min，扩增重复35个循环(退火温度：HBB 56 ℃；GLA 55 ℃；NPHS1 60 ℃)。HBB、GLA、NPHS1预计扩增片段长度分别为519 bp、433 bp、318 bp，琼脂糖凝胶电泳出现清晰目的条带的产物即送公司测序。

1.3.5PCR-反向点杂交法验证 HBB基因杂合突变个体单细胞WGA产物行PCR-反向点杂交法探讨本研究对β-珠蛋白生成障碍性贫血临床常规诊断的价值，操作严格按照PCR-反向点杂交试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1外周血单个淋巴细胞的分离淋巴细胞分离液处理前外周血白细胞以分叶核中性粒细胞为主，平均占比63%，分离后淋巴细胞平均占比94%，如图1所示，分离效果良好。经红细胞裂解液处理背景红细胞未完全消失，但为了避免有核细胞的破坏，无需进一步处理少量存在的背景红细胞。

注： A为处理前，以分叶核中性粒细胞为主；B为处理后，镜下主要为淋巴细胞。

图1 淋巴细胞分离液处理前后高倍镜视野下细胞组成(×400倍，吉姆萨染色)

2.2单细胞WGA产物单细胞WGA产物的核酸浓度波动于200～787 ng/μL，每个反应体系约67.9 μL，总核酸量均大于13 μg，初步纯度测定A260/A280约为1.4。琼脂糖凝胶电泳示所有样本均扩增成功，产物的片段长度为250～2 000 bp，与说明书片段参考范围基本一致。见图2。

2.3目的基因的扩增成功率以单细胞WGA产物为模板分别扩增目的基因HBB、GLA、NPHS1，琼脂糖凝胶电泳示扩增成功率为100%，但某些样本扩增时会出现非特异性条带、目的条带较浅的情况。见图3、4。

注：M为DNA标记物；1、2、3、4：单细胞样本；N为阴性对照；P为阳性对照。

图2 部分样本单细胞WGA电泳图

2.4目的基因一代测序健康者WGA产物目的基因测序结果与genebank登入的目的基因序列一致，携带者WGA产物目的基因测序则能够准确显示发生突变的位点，但与外周血DNA目的基因测序相比，单细胞WGA产物目的基因测序干扰较大，易引入突变。

2.5β-珠蛋白生成障碍性贫血PCR-反向点杂交 HBB基因发生CD41/42杂合突变的个体单细胞WGA产物除了利用一代测序进行珠蛋白生成障碍性贫血诊断准确性研究外，还利用PCR-反向点杂交探讨了其对于β-珠蛋白生成障碍性贫血临床常规诊断的价值，结果显示WGA产物可应用于含CD41/42突变的β-珠蛋白生成障碍性贫血常规诊断。

注：M为DNA标记物；A、B、C分别代表HBB、GLA、NPHS1基因扩增情况；P为阳性对照；N为阴性对照；1～4为以WGA产物为模板的扩增。

图3 部分健康对照人群单细胞WGA产物目的基因扩增情况

注：M为DNA标记物；A、B、C分别代表HBB、GLA、NPHS1基因扩增情况；P为阳性对照；N为阴性对照；1～2为以WGA产物为模板的扩增。

图4 部分携带者单细胞WGA产物目的基因扩增情况

3 讨论

单细胞为生物体最基本的结构和功能单位，单细胞分析可以研究生物体的生长、发育、成熟过程[4-5]；打破传统细胞生物学研究的局限，使细胞研究从群体水平向个体水平发展，揭示各组织细胞间异质性的存在[4,6-7]；单细胞WGA及高通量分析技术的发展则突显了微量细胞如宫颈脱落滋养层细胞、母体循环胎儿细胞或者循环肿瘤细胞的临床价值[8-11]；另外，单细胞分析在微生物研究中也发挥着重要作用[12]。

本研究利用单细胞分析实现了β-珠蛋白生成障碍性贫血、法布里病、先天性肾病综合征的诊断。研究采用手工显微操作分离单个淋巴细胞，该分离方法结合了连续稀释法及显微操作法，取材简单，操作简便、直观可行，较连续稀释法更能准确地分离出单个核细胞,且不需要特殊的仪器，易于普及。分离的单个淋巴细胞采用改良的WGA方法MALBAC进行扩增，该法扩增偏倚较传统方法显著降低，覆盖度可达93%以上[3,13-14]。WGA产物目的基因的扩增成功率为100%，经测序鉴定可正确诊断疾病，还可用于β-珠蛋白生成障碍性贫血临床常规诊断。

值得注意的是，某些WGA产物目的基因扩增中会引入非特异性条带，猜想与样本间WGA扩增质量的差别、模板纯度低、无法准确统一模板量相关。另外，对目的基因测序中WGA产物的干扰要大于外周血DNA，且易于引入无关突变，可能与MALBAC所用的Taq聚合酶保真性不高相关[15]。为了提高对遗传性疾病诊断的可靠性，研究中需进行以下改进：建立相应的方法评估单细胞WGA产物扩增质量，纯化扩增产物保证模板质与量，多个单细胞WGA结合分析克服扩增方法固有缺陷，正反向测序分析相结合排除假突变。