基于VEGF/VEGFR-2信号通路探讨穿山龙总皂苷促进去势大鼠骨折血管形成和骨折愈合的效果∗

安晓晖 刘 恩 吕 飞 冯志伟

（冀中能源峰峰集团总医院，河北 邯郸 056200）

绝经后骨折是一种常见的绝经后疾病，显著影响患者的生活质量。有研究报道，在绝经后早期骨缺失迅速发生，但这一过程在绝经后第6年逐渐消失，这可能是绝经后雌激素减少所致[1-2]。雌激素、甲状旁腺激素（PTH）和双膦酸盐目前用于预防绝经后骨折[3-4]。然而，研究证实，长期使用这些药物可带来一系列副作用，包括子宫内膜癌和卵巢癌的风险较高、神经系统疾病、颌骨坏死和静脉血栓栓塞。因此迫切需要一种安全、有效的替代方法或药物来治疗绝经后骨折。近几十年来，某些中药已被广泛认为是缓解或治疗骨损失的有效药物。穿山龙总皂苷具有多种生物和药理作用，可用于促进骨骼和牙齿强度。研究表明，穿山龙总皂苷可通过调节p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Wnt信号通路对卵巢切除术大鼠维持牙槽骨发挥保护作用[5-6]。穿山龙总皂苷具有抗氧化和抗炎特性，具有抗细胞凋亡作用。研究证明，穿山龙总皂苷可促进成骨细胞分化，甚至可有效逆转卵巢切除引起的骨质疏松症[7]。血管内皮生长因子（VEGF）/血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）信号通路是血管形成和骨骼愈合的主要信号调控通路[8-9]。本研究拟基于VEGF/VEGFR-2信号通路探讨穿山龙总皂苷促进去势大鼠骨折血管形成和骨折愈合的效果，为绝经后骨折的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雌性大鼠50只，体质量220～240 g，重庆医科大学实验动物中心提供，喂养环境为：温度24～26℃，湿度55%～65%。动物生产许可证号：SCXK（渝）2018-0008，动物质量合格证号：2018003746。

1.2 试药与仪器 穿山龙总皂苷（美国赛默飞世，AS59845）；地塞米松、EasyPure RNA试剂盒、3，3′-二氨基联苯胺（DAB）（美国Sigma公司，批号47844、47895、98766）；qRT-PCR SuperMix试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司，批号AM-3357）；抗VEGF抗体、抗VEGFR-2抗体（美国Abcam公司，批号ab95462、ab73400）；生物素缀合的山羊抗兔Ig抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号PV-6000）；ED-098型双能X线扫描仪（美国Hologic公司）；DM750型显微镜（德国莱卡公司）；ABI 7500型实时荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）。

1.3 分组与造模 大鼠随机分为骨折对照组、模型组、地塞米松组（10 mg/kg，预实验求出地塞米松的LC50为20.0 mg/kg，以1/2 LC50为作用剂量）、穿山龙总皂苷低剂量组（20 mg/kg，预实验求出穿山龙总皂苷的LC50为80.0 mg/kg，以1/4 LC50为低剂量）、穿山龙总皂苷高剂量组（40 mg/kg，预实验求出穿山龙总皂苷的LC50为80.0 mg/kg，以1/2 LC50为高剂量）。模型组、地塞米松组、穿山龙总皂苷低、高剂量组经戊巴比妥钠（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，常规消毒后取双侧背侧切口，切除双侧卵巢，建立去势模型。术后4周建立股骨的简单横向闭合性骨折，简而言之，在术前肌内注射青霉素（150 IU/kg）后，在全身麻醉和无菌条件下进行手术，在右膝侧面切开切口以暴露股骨远端的关节面，将10号（10 mm）针插入髓管中用于固定，通过压平尖端和远端来实现旋转稳定性，然后闭合切口，使用钝性创伤产生骨折，闭合伤口后，在三点弯曲机构上产生500 g质量的中间骨干骨折，质量的下落高度为30 cm，骨折采用放射学记录，确认骨折状态。骨折对照组如前所述，只建立股骨的简单横向闭合性骨折。建模成功后，地塞米松组（10 mg/kg）、穿山龙总皂苷低剂量组（20 mg/kg）、穿山龙总皂苷高剂量组（40 mg/kg）给予相应药物灌胃，模型组、骨折对照组给予等体积的0.9%氯化钠注射液，每日1次，持续时间为4周。

1.4 标本采集与检测 股骨折后骨痂处骨密度、血管数量测定：ED-098型双能X线扫描仪对股骨折后骨痂处骨密度进行测定；每张切片在高倍镜下任选10个视野，每个视野计数血管数量水平。股骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2基因水平测定：EasyPure RNA试剂盒提取骨总RNA，TransScript Green一步法qRT-PCR SuperMix试剂盒用于检测RNA测试基因相对表达水平。在20 μL反应体系中加入1 μL模板 RNA，0.2 μmol/L正向和 0.2 μmol/L反向引物，10 μL 2XTransStart提示绿色qPCR SuperMix，0.4 μL一步RT酶混合物，0.4 μL无源参比染料Ⅱ和无RNase水。qRT-PCR条件为：45℃5 min，95℃30 s，然后40个循环，每个循环包含94℃5 s和60℃30 s。ABI 7500型实时荧光定量PCR仪用于测量基因表达。引物序列为如下。VEGF PF：5′-GGACAGGACGCACAGTCA-3′，VEGF PR：5′-CA GACGAGGCTCCGTGGT-3′。VEGFR-2 PF：5′-TGGT CGCCATCAAGAAAGTATTG-3′。 VEGFR-2 PR：5′-GCGTCTGTTTGGCTCGACTAT-3′。U6 PF：5′-ATTGG AACGATACAGAGAAGATT-3′。U6 PR：5′-GGAACG CTTCACGAATTTG-3′。股骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2蛋白水平测定：用抗VEGF抗体和抗VEGFR-2抗体分别稀释至1∶200评估股骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2蛋白表达。根据制造商建议的方案进行免疫组织化学方案，通过将切片与胰酶在37℃温育30 min来回收抗原，将切片与一抗在4℃温育过夜，没有第一抗体孵育的载玻片用作阴性对照，用3%H2O2阻断内源过氧化物酶活性，并将切片在Tris缓冲盐水（pH7.6）中洗涤，用Tris缓冲盐水冲洗15 min后，应用生物素缀合的山羊抗兔Ig抗体作为二抗，通过应用3，3′-二氨基联苯胺（DAB）显色，切片用Mayer′s苏木精复染，并在分级乙醇和二甲苯系列中脱水，使用显微镜（×200）在来自骨折部位的3个随机选择的光学区域中检查软骨组织中阳性细胞的百分比。所有评估均以盲法进行，为了定量免疫反应性，细胞质中的黄褐色颗粒代表阳性细胞。免疫组化评分（IHS）定义为阳性细胞百分比和阳性细胞染色强度如下：阳性细胞百分比（无阳性细胞=0，1-10%阳性细胞=1，11-50%=2，51-80%=3，81-100%=4）乘以阳性细胞的染色强度（阴性=0，弱阳性=1，中度阳性=2，强正=3）。

1.5 统计学处理 应用SPSS23.0对数据进行录入、统计学分析。计量数据以（）表示，采用单因素方差分析比较，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠骨折后骨痂处骨密度、血管数量的比较 见表1。与骨折对照组比较，模型组骨折后骨痂处骨密度、血管数量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，地塞米松组、穿山龙总皂苷低剂量组、穿山龙总皂苷高剂量组骨密度、血管数量明显升高（P＜0.05），且穿山龙总皂苷高剂量组骨密度、血管数量高于穿山龙总皂苷低剂量组（P＜0.05）；与地塞米松组比较，穿山龙总皂苷低剂量组骨密度、血管数量明显降低（P＜0.05），穿山龙总皂苷高剂量组骨密度、血管数量无明显变化（P＞0.05）。

表1 各组大鼠骨折后骨痂处骨密度、血管数量的比较（±s）

表1 各组大鼠骨折后骨痂处骨密度、血管数量的比较（±s）

与骨折对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与地塞米松组比较，#P＜0.05；与穿山龙总皂苷低剂量组比较，◇P＜0.05。下同

组别骨折对照组模型组地塞米松组穿山龙总皂苷低剂量组穿山龙总皂苷高剂量组n 10 10 10 10 10骨密度（mg/cm2）165.45±16.13 113.65±13.97*142.32±19.63△126.36±15.99△#142.69±16.34△◇血管数量（条）45.63±25.99 10.36±8.66**35.96±11.21△18.63±13.65△#36.96±16.54△◇

2.2 各组大鼠骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA表达水平比较 见表2。与骨折对照组比较，模型组骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，地塞米松组、穿山龙总皂苷低剂量组、穿山龙总皂苷高剂量组VEGF、VEGFR-2 mRNA表达水平明显升高（P＜0.05），且穿山龙总皂苷高剂量组VEGF、VEGFR-2 mRNA表达水平高于穿山龙总皂苷低剂量组（P＜0.05）；与地塞米松组比较，穿山龙总皂苷低剂量组VEGF、VEGFR-2 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05），穿山龙总皂苷高剂量组VEGF、VEGFR-2 mRNA表达水平无明显变化（P＞0.05）。

表2 各组大鼠骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA表达水平比较（±s）

组别骨折对照组模型组地塞米松组穿山龙总皂苷低剂量组穿山龙总皂苷高剂量组n 10 10 10 10 10 VEGF mRNA 6.56±0.24 0.96±0.26*5.19±0.25△2.29±0.29△#5.16±0.28△◇VEGFR-2 mRNA 5.98±0.25 0.87±0.19*4.69±0.54△2.55±0.53△#4.71±0.35△◇

2.3 各组大鼠骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2 蛋白表达水平比较 见表3，图1，图2。与骨折对照组比较，模型组骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，地塞米松组、穿山龙总皂苷低、高剂量组VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），且穿山龙总皂苷高剂量组VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平高于穿山龙总皂苷低剂量组（P＜0.05）；与地塞米松组比较，穿山龙总皂苷低剂量组VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），穿山龙总皂苷高剂量组VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平无明显变化（P＜0.05）。

表3 各组大鼠骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平比较（±s）

组别骨折对照组模型组地塞米松组穿山龙总皂苷低剂量组穿山龙总皂苷高剂量组n 10 10 10 10 10 VEGF 9.67±0.56 2.36±0.65*6.55±0.59△4.96±0.72△#6.60±0.61△◇VEGFR-2 8.55±0.54 2.95±0.59*6.24±0.58△4.36±0.53△#6.32±0.59△◇

3 讨论

图1 各组大鼠骨折后骨痂处VEGF蛋白表达水平比较（DAB染色，200倍）

图2 各组大鼠骨折后骨痂处VEGFR-2蛋白表达水平比较（DAB染色，200倍）

穿山龙总皂苷具有多种药理作用，已被证明可以增加骨形态成形蛋白-2（BMP-2）的表达，诱导骨形成，并抑制骨吸收[10]。研究证实，在糖尿病大鼠模型中，穿山龙总皂苷介导血管内皮生长因子-c（VEGF-c），IFG-1和转化生长因子-β（TGF-β）合成改善毛细血管密度，增强血管生成，从而增加大鼠模型中糖尿病足溃疡的伤口破裂强度[11-12]。本研究首次从血管新生的角度研究了穿山龙总皂苷对去势大鼠骨折的作用和机制。研究发现，与骨折对照组比较，模型组骨折后骨痂处骨密度、血管数量明显降低；与模型组比较，地塞米松组、穿山龙总皂苷低剂量组、高剂量组骨密度、血管数量明显升高，且穿山龙总皂苷高剂量组骨密度、血管数量高于穿山龙总皂苷低剂量组；与地塞米松组比较，穿山龙总皂苷低剂量组骨密度、血管数量明显降低，穿山龙总皂苷高剂量组骨密度、血管数量无明显变化。这说明穿山龙总皂苷可以诱导更多的新血管形成，加速骨愈合。

雌激素和营养缺乏和骨质疏松症及骨折密切相关。老年妇女中发生骨质疏松症的主要原因是这类人群缺乏雌激素和血液供应减少。研究发现，当发生骨质疏松症时，毛细血管和血窦的数量会减少。而在血管生成中起关键作用的VEGF在卵巢切除大鼠的骨中水平明显降低。因此，增加VEGF水平可促进血管生成，增加骨量和治疗骨质疏松症[13-14]。由于骨折末端的局部脉管系统破裂导致血肿形成，形成相对区域性的缺氧微环境。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是调节细胞对缺氧反应的重要因子。研究证实HIF-1α在骨愈合过程中表达，表明激活HIF-1α信号通路可诱导VEGF介导的反应可以加速骨愈合。VEGF/VEGFR-2信号通路对血管生成和骨折愈合至关重要，研究报道通过VEGF拮抗剂和可溶性VEGFR抑制VEGF活性导致小鼠股骨骨折和皮质骨缺损的愈合受损，VEGF的局部给药可以改善两种模型中的骨修复[15-16]。VEGFR-2可以与雌激素受体结合，促进VEGF的表达，VEGF是促进血管生成的关键因子，从而改善基质中的增殖和黏附[17-18]。本次研究结果显示，与骨折对照组比较，模型组骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA、蛋白表达水平明显降低；与模型组比较，地塞米松组、穿山龙总皂苷低剂量组、穿山龙总皂苷高剂量组骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA、蛋白表达水平明显升高，且穿山龙总皂苷高剂量组骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA、蛋白表达水平高于穿山龙总皂苷低剂量组；与地塞米松组比较，穿山龙总皂苷低剂量组骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表达明显降低，穿山龙总皂苷高剂量组VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表达无明显变化。这与上述讨论一致，同时说明，穿山龙总皂苷可促进去势大鼠骨折骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表达水平，进而激活VEGF/VEGFR-2信号通路。

综上所述，穿山龙总皂苷可促进去势大鼠骨折血管形成和骨折愈合，其机制与穿山龙总皂苷可促进去势大鼠骨折骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA、蛋白表达水平，进而激活VEGF/VEGFR-2信号通路有关。