基于网络药理学探讨灯盏细辛治疗冠心病的作用机制∗

赖 橼 郑 雪 鲁卫星

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029）

冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）简称冠心病，是冠状动脉粥样硬化引起血管阻塞、狭窄，使心肌细胞缺血缺氧或坏死引起的心脏病[1]。冠心病发病与动脉粥样硬化紧密相关，其机制主要集中在炎症反应和脂质浸润这两类学说上。

冠心病属中医学“胸痹”“真心痛”范畴，运用中医药治疗疗效颇佳。其中灯盏细辛作为西南部地区少数民族的常用草本药，具有活血通络止痛、祛风散寒的功效[2]，可用于治疗因血瘀所致的各种疼痛不适。近年来，临床上将灯盏细辛注射液用于治疗心脑血管病的报道屡见不鲜。有研究表明，灯盏细辛所含的成分对神经、心脑血管等靶器官具有明显的保护作用，但其药效物质基础和作用机制仍不明确。本研究通过网络药理学的方法，对灯盏细辛进行靶点、通路复杂的网络关系研究，尝试从多靶点、多通路角度说明灯盏细辛治疗冠心病的可能机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 灯盏细辛化学成分收集与靶点筛选 通过运用西北农林科技大学自主研发的中药系统药理学数据库与分析平台 TCMSP（http：//tcmspw.com/index.php），在该平台中以“灯盏细辛”为关键词进行初步检索，得到灯盏细辛所有化学成分。在检索结果中设置口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为筛选参数，进一步检索灯盏细辛的化学成分。然后利用TCMSP数据库平台，对上述结果进行系统搜索匹配，得到灯盏细辛有效成分的蛋白靶点。

1.2 疾病相关靶点筛选 以冠心病英文名称“coronary disease”作为关键词，在Genecards数据库（https：//www.genecards.org）中检索与冠心病相关的靶点。

1.3 网络模型构建 将“1.1”及“1.2”中所得到的靶点导入Cytoscape3.6.1软件进行灯盏细辛有效成分和冠心病靶点之间的网络图构建。并将上述获得的灯盏细辛有效成分靶点和冠心病疾病靶点上传至在线韦恩图（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），得到灯盏细辛与冠心病的交集靶点，再利用STRING10.5数据库（https：//string-db.org）得到交集靶点相互作用关系网络图（PPI）。

1.4 富集分析 通过DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov）将上述得到治疗冠心病的靶点导入其中，设置阈值P＜0.05，对靶点生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）进行GO富集分析和KEGG代谢通路富集分析，并采用线上绘图工具Omic Share Tool（https：//www.omicshare.com/tools/index.php/）将富集结果可视化，以进一步说明灯盏细辛治疗冠心病的作用机制。

2 结 果

2.1 化学成分及其作用靶点分析 以“灯盏细辛”为关键字检索到灯盏细辛的化学成分共49个，设置筛选参数OB≥30%，DL≥0.18后，得到灯盏细辛主要活性成分12个，剔除无对应靶点的1个成分，共获得11个潜在有效成分。见表1。再次把灯盏细辛有效成分带入TCMSP数据库中检索，得到有效成分相关的靶点331个。在Pharm Mapper中剔除所有重复的靶点，最后整理得到灯盏细辛有效靶点184个。在Gene cards数据库中，以“coronary disease”为关键词，检索出冠心病相关靶点6 704个。

将灯盏细辛184个靶点与冠心病疾病靶点上传至在线韦恩图，得到两者的交集靶点共155个，韦恩图详见图1。交集靶点分别为：PTGS1、AR、PTGS2、PRSS1、NCOA2、RELA、EGFR、AKT1、VEGFA、CCND1、BCL2L1、CDKN1A、CASP9、MMP2、MMP9、MAPK1、IL10、RB1、JUN、IL6、CASP3、NFKBIA、MDM2、APP、MMP1、PC-NA、ERBB2、PPARG、HMOX1、CASP7、ICAM1、MCL1、BIRC5、IL2、CCNB1、IFNG、IL4、GSTP1、SLC2A4、INSR、CD40LG、PTGES、MET、AKR1B1、KCNH2、SCN5A、ADRB2、MMP3、F7、RXRA、ACHE、MAOB、BCL2、FOS、BAX、PLAU、EGF、ELK1、POR、ODC1、CASP8、RAF1、SOD1、PRKCA、HIF1A、STAT1、ACACA、CYP3A4、CYP1A2、CAV1、MYC、F3、GJA1、CYP1A1、IL1B、CCL2、SELE、VCAM1、CXCL8、PRKCB、DUOX2、NOS3、HSPB1、MGAM、NR1I2、CYP1B1、PLAT、THBD、SERPINE1、COL1A1、ALOX5、IL1A、MPO、NCF1、ABCG2、HAS2、NFE2L2、NQO1、PARP1、AHR、COL3A1、CXCL11、NR1I3、CLDN4、PPARA、PPARD、HSF1、CRP、CXCL10、CHUK、SPP1、RUNX2、E2F1、E2F2、CTSD、IGFBP3、IGF2、IRF1、ERBB3、PON1、DIO1、PCOLCE、HK2、RASA1、GSTM1、GSTM2、NOS2、CHRM1、ESR1、ADRA1A、SLC6A4、ESR2、MAPK14、GSK3B、CCNA2、ATP5F1B、PGR、SLC6A2、CHRM2、ADRA1B、IKBKB、MAPK8、PPP3CA、AKR1C3、SLPI、NR3C2、NR3C1、NCOA1、FOSL1、CYCS、ALOX12、NFATC1、EGLN1、NOX5、APOD。

表1 灯盏细辛有效活性成分

图1 灯盏细辛有效成分与冠心病靶点交集

2.2 有效成分-靶点相互作用网络 见图2。通过Cytoscape3.6.1构建灯盏细辛有效成分治疗冠心病靶点相互作用网络图，右边深色多边形代表灯盏细辛，其外圈为灯盏细辛主要有效成分；左边深色多边形代表冠心病，其两层外圈均为冠心病相关靶点；每条边代表有效成分与作用靶点之间的关系。由图可知，灯盏细辛有效成分与冠心病的内圈靶点关联边比外圈边更密集，因此内圈的靶点为灯盏细辛治疗冠心病的核心靶点，也体现了灯盏细辛治疗冠心病多成分、多靶点共同作用的特点。

图2 有效成分-靶点相互作用网络图

2.3 交集靶点相互作用网络 将155个交集靶点导入STRING数据库得到交集靶点相互作用关系网络图，见图3。图中包括节点155个，边2625条，节点代表靶点，边代表作用靶点之间的关联。节点发出的边越多，则代表两个靶点间的关联越密切，发出边越多的节点则越可能为网络图中的核心靶点基因。统计其中关联度最高的前30个靶点，见图4。

图3 灯盏细辛与冠心病交集靶点

2.4 GO富集分析 将155个靶点信息导入DAVID数据库中，从生物过程、细胞组分、分子功能3个水平对关键靶点进行GO富集分析，分别得到生物过程（BP）条目2 155个，细胞组分（CC）条目60个、分子功能（MF）条目152个，并以P＜0.05筛选整合排名靠前的条目，分别取富集程度较高的前10个绘制成图，见图5。

图4 PPI网络核心基因统计图

图5 GO功能富集分析

2.5 KEGG通路富集分析 同样通过DAVID数据库，对灯盏细辛治疗冠心病的主要155个靶点进行KEGG通路富集分析，得到信号通路162条，同样以P＜0.05筛选整合排名靠前的条目并选取其中所含靶点数量较高的前30条转化为可视化图，见图6。

图6 KEGG富集分析

3 讨 论

网络药理学是采用网络分析的模式，对中药的物质基础、生物效应及其药效机制开展网格化、系统化的整合研究[3]。网络药理学的兴起，将古今中外的信息、内容、技术相融合，为现代研究中医药治疗疾病的作用机制提供了更为广阔的思路和方法。

本研究通过网络药理学的方法探讨灯盏细辛治疗冠心病的作用机制，结果得到11个有效成分，155个作用于冠心病的主要靶点。有效成分包括木樨草素、槲皮素、芒柄花素、山奈酚等[4-6]，有研究表明这些成分对心肌细胞具有保护作用。而从PPI网络图的分析中可知，灯盏细辛作用靶点与冠心病靶点之间相互影响，靶点间的关系错综复杂，表明其治疗作用机制复杂多样。统计其中关联性最高的靶点，位于前几位的靶点分别为AKT1、IL-6、VEGFA、JUN、CASP3，这些靶点主要参与了细胞凋亡、血管生成、炎症反应等过程。AKT1是PI3K通路中的一个重要蛋白，是AKT 3个同种型蛋白结构中的一种[7]。AKT又称为蛋白激酶B，在葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖和转录中具有关键作用[8]；在心血管系统中一旦被胰岛素、血小板衍化生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）等激活，这些生长因子通过转录或翻译机制调节AKT活性[9]。CASP3属于凋亡蛋白酶亚科中的一种，其激活方式主要通过受损的细胞线粒体膜，从胞内释放到胞外来诱导细胞发生凋亡[10]。AKT活化后可以调节VEGF介导的血管生长，使内皮细胞迁移来减慢心功能受损速度，同时通过抑制心肌细胞凋亡来增加心肌细胞活性[9]。IL-6由单核巨噬细胞和淋巴细胞产生，是一种常见的炎症因子。它不仅可以引发血管壁损伤，另一方面还可诱导肝脏产生CRP，加速冠心病进程[11]。黄乐等研究发现，随着冠心病病变程度增加，血清中IL-6水平随之增高，因此可推断IL-6与冠心病呈正相关性[12]。JUN是组成转录因子AP-1（激活蛋白-1）的一类蛋白族，包括c-JUN、v-JUN、JUN B和JUN D这几个亚单位。韩畅畅、伍培等研究认为AP-1通过对各种生长因子和细胞因子的转录，参与调节细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等多种细胞过程，其中c-JUN蛋白对诱导炎性介质分泌起重要作用[13-14]。综上所述，本研究团队推测认为灯盏细辛一方面通过激活AKT1蛋白保护心肌细胞，一方面单独通过抑制IL-6介导的炎症反应，减缓炎症反应造成的冠脉粥样硬化；同时从JUN蛋白方面调控炎性介质分泌，从而减慢冠心病形成过程中的炎症反应。由此说明，灯盏细辛治疗冠心病可能是依靠多靶点相互影响、共同调节的作用机制。

本研究对灯盏细辛治疗冠心病的155个主要靶点进行GO生物过程富集，主要涉及氧化应激反应、代谢反应等。KEGG富集分析结果显示，灯盏细辛主要参与PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGERAGE信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等。PI3K-Akt信号通路的激活影响着心肌细胞存活、增殖、凋亡以及心肌细胞能量代谢及调节，血管再生等，其在调控心肌细胞存活和功能方面起着重要作用[9，15]。动脉粥样硬化是冠心病的发生发展基础，关键的病理生理过程为巨噬细胞胆固醇代谢紊乱从而形成泡沫细胞[16]，其中涉及的巨噬细胞胆固醇摄取能力对脂质积累起到重要作用[17]。徐雷等研究认为，AGE-RAGE信号通路通过干预SRA2和CD36表达来介导巨噬细胞胆固醇的代谢，从而影响糖尿病并发症中的大血管病变，进一步导致冠心病的发生[18]。MAPK信号通路是细胞信号转导的调节通路之一，参与细胞增殖、凋亡、炎症、免疫应答等过程，主要包括了ERK、p38 MAPK和JNK信号通路。其中p38 MAPK信号通路磷酸化后生成p-p38 MAPK发挥促进心肌细胞凋亡的作用[19]；p38 MAPK信号通路激活后还使细胞内的炎症因子水平升高，进一步诱发巨噬细胞炎症反应的发生[20]。HIF-1α是HIF-1信号通路中的重要因子，HIF1的生理活性主要是由HIF-1α决定。巩晓东等研究发现，虽然在心肌缺血时HIF-1α的稳定表达对心肌有一定保护作用，但当HIF-1α表达水平增高时，冠脉软斑块的发病率也相应增高[21]。这可能与患者血清缺氧和炎症反应程度明显增加有关，导致患者血管内皮损伤更加严重、更容易形成软斑块。以上表明，灯盏细辛作用靶点可能通过分布于不同代谢通路，相互调节治疗冠心病的作用机制。

综上所述，灯盏细辛治疗冠心病的过程涉及多个有效成分，作用靶点和通路，从靶点基因的角度初步验证了灯盏细辛治疗冠心病的药理学作用机制，为后续进一步研究奠定了基础。由于本研究仅依据生物利用度和类药性这一常用筛选标准作为筛选条件，因此对于生物利用度较低但在临床研究中较为重视的成分有所漏筛，未能将这些成分纳入研究中来，是本研究存在的不足之处。