HBV感染型原发性肝癌患者肿瘤微环境中CD4+、CD8+T细胞和VEGF水平变化特征及其临床意义

方菊梅 张万里 陈怡发 刘黎明 黄庆勇

原发性肝癌在临床治疗中是1种比较常见的恶性消化道肿瘤之一，发病人群主要在40～50岁的中年男性人群中[1-2]。目前具体的发病机制还没有找到，但普遍认同这一观点：病毒性肝炎、肝硬化以及黄曲霉素等化学致癌物质病变、环境因素与原发性肝癌之间有着一定的联系，而最主要的危险因素是长期慢性HBV感染[3-4]。原发性肝癌肿瘤恶性程度非常高，其外形质地坚硬，边缘不整齐且表面凹凸不平，呈巨快型或者大小结节型。早期肿瘤可随时在脑、肺、骨等多处进行转移，还有相应的并发症产生，显著突出的并发症有癌肿破裂出血、肝性昏迷、上消化道出血以及继发性感染。少部分的病人会出现高胆固醇血症、红细胞增多症、低血糖、高血钙等特殊的症状[5-6]。肿瘤的迅速生长增加了肝包膜的张力，造成一定的肝区疼痛，这也是原发性肝癌的首发症状将，随后再出现全身和消化道不适等症状。同时，肿瘤细胞的免疫耐受程度也影响到肝癌细胞的生长[7-8]。由于原发性肝癌不易立即诊断出，且治疗难，病情发展迅速，临床上通常采用手术进行根除，但大多数患者术后的预后性差，复发转移率仍比较高。近年来研究指出，VEGF作为最强的促血管生长因子，其水平的变化会直接影响到肿瘤血管的形成。淋巴浸润程度也被发现与肿瘤细胞数量有联系。国内外有关的研究表明，CD4+、CD8+T细胞亚群高水平的表达会减少患者的免疫耐受发生[9-11]。但现有的研究在研究HBV感染性原发性肝癌患者肿瘤微环境中VEGF和T细胞亚群水平和VEGF水平变化特点这一方面比较少。因此，笔者根据多年的临床经验，对是否感染HBV型原发性肝癌肿瘤患者微环境中CD4+、CD8+T细胞表达情况及血清VEGF水平变化进行研究，为临床研究提供可靠客观的依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院2016年5月至2017年11月期间收治的94例原发性肝癌患者作为研究对象，按照是否感染HBV进行分组，其中对照组为非HBV感染型原发性肝癌患者40例，观察组为感染HBV型原发性肝癌患者54例，参照国际抗癌联盟(union for international cancer control，UICC)分期标准[12]：18例I期患者，11例Ⅱ期患者，16例Ⅲ期患者，9例Ⅳ期患者。对照组中男性26例，女性14例，年龄35～50岁，平均年龄(49.9±7.4)岁，体质量指数为(21.1±2.4)kg/m2；观察组男性35例，女性19例，年龄38～55岁，平均年龄(48.8±7.0)岁，体质量指数为(22.2±1.3)kg/m2，两组患者在年龄、性别及体重指数等一般资料差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 两组一般资料比较(例，%)

1.2 研究对象选定标准

纳入标准：①参照《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)[13]的诊断标准，确诊为HBV感染患者；②采集的肝穿刺活检标本≥1 cm；③经过本院伦理委员会和患者本人同意，均签署书面知情同意书。

排除标准：①妊娠或哺乳期妇女；②患有酒精性肝病、自身免疫性肝病、药物性肝损伤；③由于其他原因造成临床资料不全者、中断治疗者。

1.3 检测方案

1.3.1 CD4+、CD8+T细胞的检测 对所有患者的肝穿刺活检标本或肝癌根治切除标本进行采集，6 h内处理，采用购自美国BioLegend公司的流式细胞仪(FCM)对CD4+、CD8+T细胞进行检测。

1.3.2 检测血清VEGF 采集所有患者外周静脉血各4 ml，3 000 r/min离心10 min，取离心后上清液置于Eppendorf(艾本德)离心管中，在-70 ℃条件下储存。采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunoSorbent assay,ELISA)对血清中的VEGF进行测定。试剂和购自上海波亚生物科技有限公司，严格按照指导说明书进行操作。

1.4 观察指标

①肿瘤微环境中CD4+、CD8+T细胞表达情况，并计算CD4+、CD8+T细胞各占细胞的比例；②VEGF水平：血清VEGF是反应肿瘤新生血管形成活跃程度的重要指标，其高水平的表达或过度表达直接或间接影响到肿瘤侵袭、转移程度。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 两组患者CD4+、CD8+T细胞水平的比较

观察组感染HBV患者的CD4+T细胞水平明显高于对照组，而CD8+T细胞水平要远远低于对照组，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者CD4+、CD8+T细胞高水平表达情况比较(例，%)

2.2 两组患者血清VEGF水平比较

观察组患者血清VEGF水平显著高于对照组，差异比较具有统计学意义(P<0.001)，见表3。

表3 两组患者血清VEGF水平比较

3 讨论

我国属于肝癌高发病率区，肝癌肿瘤恶性增殖迅速，术后生存率低，预后性差，严重威胁患者生命安全及身心健康，同时也给患者及其家属带来经济、生活上的压力，也是引发中老年人死亡的原因之一[13-14]。肝癌的发生，肿瘤的恶性增殖、转移、复发都是极其复杂的过程。

胸腺依赖性淋巴细胞(T细胞)是胸腺中分化成熟的淋巴细胞，在淋巴和血液循环中逐渐遍布至机体的免疫器官和组织中，并且发挥免疫功能。其生物学功能较多[15-16]，比如，辅助性T细胞(Helper T cells,Th)、抑制性T细胞(Suppressor T cells,Ts)、细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells,Tc)、效应T细胞(Effector T cells,Te)、迟发性变态反应T细胞(Delayed type hypersensitivityT cells,Td)、记忆T细胞(Memory T cell,Tm)等等。按其生物功能可分为Th1、Th2和Th17细胞亚群[17]，其中Th1细胞亚群在抗瘤反应中产生更为强大的抗肿瘤免疫反应；Th2主要管理机体的体液免疫，其分泌的IL-4细胞因子对CD8+T细胞有一定的直接抑制作用[18-19]。CD3细胞是成熟T淋巴细胞的表面标志，参与T细胞的信号传导，稳定T细胞受体(T cell receptor，TCR)结构，启动细胞内的活化过程；CD4是Th细胞[20]的主要表面标志，能够增强吞噬细胞介导的抗感染作用和提高B淋巴细胞介导的体液免疫应答，协助体液免疫和细胞免疫功能(在肿瘤免疫过程中对CD8+T细胞和B细胞起到重要的协助作用)；而CD8是Tc细胞表面的主要标志，具有抑制性和杀伤力，可对产生特殊抗原反应的目标细胞直接进行杀灭[21]；CD4/CD8的比值反映机体免疫功能的稳定情况[22]。许多学者认为，肿瘤细胞能够对肝癌患者进行免疫耐受，通过提高调节性T淋巴细胞水平来减少患者的免疫功能；或者降低CD8+细胞来减少Tc细胞水平，削弱机体的免疫功能丧失对肿瘤细胞的杀伤力[23]；而肿瘤细胞可以改变本身分子表面的受体，从而增加了对免疫系统的抵抗力。刘伯阳等[24-25]学者也指出，肝癌患者的肿瘤细胞的增殖和淋巴细胞的浸润关联紧密，原发性肝癌患者外周血单个核细胞中的CD4+T细胞水平越高、CD8+T细胞越低说明患者的预后性就越差，本文的研究结果与之一致：观察组感染HBV患者的CD4+T细胞水平明显高于对照组，而CD8+T细胞水平低于对照组。这是因为HBV感染原发性患者随着肿瘤的侵袭和转移，其机体自身的免疫功能不足以对抗肿瘤，引起CD4+T细胞水平上升，一旦CD4+T细胞水平上升其功能作用受到抑制，又大大削弱体液免疫和细胞免疫；同理CD8+T细胞水平大幅度的下降，Tc细胞也随之减少，不能发挥对靶细胞的杀伤作用。

目前，诱发原发性肝癌的发生主要因素有食物中的黄霉菌污染、吸烟、病毒性肝炎、性传播等，但大量的临床诊治表明，感染HBV和原发性肝癌的发生两者之间关系最为紧密。HBV是公认的全球性公共卫生问题，在基因工程疫苗的生产和普及下，其感染率得到有效的控制HBV是诱发乙肝的病原体，其属于嗜肝DNA病毒科，而引起机体感染的是正嗜肝DNA病毒属。

多血管性是肝癌组织中最典型的特征，肿瘤的侵袭和转移在新生血管的基础上进行。由于新生毛细血管壁较薄弱，通同性较大，使得肿瘤细胞很容易通过。在毛细血管形成的过程中，内皮细胞所产生的Ⅳ型胶原酶和纤溶酶原激活活物等，这些多种基质的降解酶能够对血管基质屏障进行破坏，从而促进肿瘤细胞的大量转移。而VEGF是肿瘤组织中最关键的内源性血管发生因子，具有促进血管通透性的增加，刺激血管内皮细胞的迁移和增殖，细胞外基质的变形及血管的形成特点，还有5种不同的亚型模式。大量研究表明，VEGF的高表达在门静脉血栓、肿瘤复发过程、微血管浸润中存在的很大联系。其作用过程是，通过细胞小囊泡器的快速、短时间的特点来提高VEGF水平，进而扩大血管的通透性，是最强增加血管通透性的物质之一。VEGF它有强大的功能可以产生众多的生物学效应的细胞因子，而其中部分细胞因子与肝素的亲和力非常之高，VEFG在人类及动物的体内都能够检测出，主要分布于各重要脏器与骨骼组织之中。VEFG具有极强的促血管生成的作用，在人体肿瘤的生长发展中属于重要的1种物质，癌细胞繁殖、突变、激活、都会出现VEGF过度表达的情况，VEGF过度表达达或增加会影响肿瘤的侵袭和转移。本研究结果也显示，观察组患者血清VEGF水平显著高于对照组，差异比较具有统计学意义，这说明肝癌细胞能产生大量的VEGF，大幅度提高了其表达水平，以此促进肝癌细胞的增殖。因VEGF可让微血管的通透性增强，让血浆纤维蛋白外泄情况加剧，这对于肿瘤的的繁殖增加提供了非常好的条件，VEGF让内皮细胞中的囊泡小体进行结合，这在细胞膜上形成了小孔，从而让各种生物细胞、分子从中进行跨膜转运。在此情况下对于血管的生成，癌细胞因子进入其他相邻细胞与血管提供了非常充分的先天条件，让肿瘤的发生与展、浸润提供了非常好的环境。

综上所诉，HBV感染型原发性肝癌患者肿瘤微环境中CD4+、CD8+T细胞以及血清VEGF水平的表达情况在肝癌病情发展过程中有着重要的意义，从这三个指标表达情况上既可以初步了解患机体免疫情况以及其病情和转移状态，让我们更进一步了解肝癌的生物化学行为，为日后肝癌的治疗提供可靠的治疗方向。