木本泥炭对红黄壤性水田土壤有机质提升和细菌群落组成的影响①

陈美淇，马 垒，赵炳梓，范树印，谭 钧，鞠振山，朱锦尉，徐国华，王淑媛，徐基胜，张佳宝*

(1 土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中国科学院大学，北京 100049；3 国土资源部土地整治中心，北京 100035；4 北京中向利丰科技有限公司，北京 100004；5 浙江省土地整理中心，杭州 310007；6 杭州市桐庐县国土资源局，杭州 311500)

土壤有机质(SOM)是土壤肥力的重要指标，也是土壤质量组成成分[1]。田间长期试验结果表明，SOM 含量与作物产量显著正相关，也与土壤生化性质显著正相关[2]。SOM 主要指土壤腐殖质，包括非腐殖物质和腐殖物质。非腐殖物质是与有机残体组分类似的普通有机化合物，占SOM 的 20% ～30%，腐殖物质主要指经微生物作用合成的高分子化合物，占SOM 的70% 左右[3]。腐殖物质是土壤中不易为微生物利用、最为稳定的有机质部分。因此在土壤中人为添加与腐殖质类似物质，可能短期能快速提高 SOM 含量。木本泥炭是木本植物残体在沼泽环境中转换、积累形成的有机资源，含碳量高，纤维素含量低，是一种重要的腐殖酸资源[4]，但其施入土壤后对作物产量和理化性质的影响尚不清楚。

秸秆还田是提高 SOM、改善土壤肥力的重要措施之一[5]，然而秸秆还田也可能引起当季作物减产以及土壤养分提升缓慢等负激发效应[6]，主要由于秸秆分解缓慢，养分不能为当季作物利用，分解过程中土壤微生物与作物争夺养分所致[7-8]；此外，秸秆还田引发病虫害的几率也可能增高[9]。因此，如何通过各种方法加速秸秆分解成为热点问题。室内研究表明，添加菌剂能有效促进秸秆分解，提高土壤速效养分含量以及酶活性[10-11]；也有田间试验发现，秸秆还田后接种菌剂能降低秸秆残渣中C/N，有效加快秸秆分解[12]，赵伟等[13]在东北黑土区田间试验表明添加菌剂能显著增加土壤有机质、微生物生物量碳氮含量。但也有研究与上述结论相反，吴琴燕等[14]发现添加3 种菌剂并不能促进秸秆分解，秸秆分解主要依赖自身含有的微生物。同时，现有菌剂制品在田间实际应用效果并不稳定，刘海静等[15]发现，菌剂对木质素降解能力有限，并且在不同栽培模式下，菌剂作用也有显著差异。这就需要从另一个角度寻求秸秆快速分解技术。外源有机碳有刺激微生物繁殖、提高微生物活性的潜力[16]，从而可能激发秸秆的分解[17]，但激发效应如何(正或负)，与添加的碳类型相关。已有研究发现，碳类型是影响微生物群落结构改变的主要因素[18]，这可能与土壤微生物与不同类型外源碳之间耦合关系不同有关[19]。

浙北地区为典型红黄壤性土壤，当地主要种植系统为每年单季水稻。丘陵山区具有大量的未开发土地，如何快速提升基于丘陵山区土壤的新垦耕地的SOM 含量是评估其是否具有开发潜力的必要条件之一。本研究拟以新垦红黄壤性水田土壤为研究对象，选择 3 种不同碳源的商用激发剂，通过田间试验比较研究不同激发剂对腐熟秸秆和木本泥炭联合施用的水稻土上的产量和土壤性质的影响，同时基于高通量测序技术明确不同激发剂对土壤细菌群落结构的影响，并评估其潜在的秸秆激发能力，为激发剂推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 田间试验

田间试验开始于2016 年，位于浙江省桐庐县钟山乡陇西村(119°21′56.7″E，29°49′19.5″N)。该地区属亚热带季风气候区，年均温16.5 ℃，年降雨量1 443.1 mm，无霜期252 d[20]。当地典型种植模式为单季水稻，6 月上旬插秧至9 月底收获。水稻土发育于红黄壤，试验前土壤pH 为6.15，有机质含量10.4 g/kg，全氮28.4 mg/kg，全钾50.4 mg/kg，全磷 358.1 mg/kg，土壤砂粒含量680.5 g/kg，粉粒248.9 g/kg，黏粒70.6 g/kg。

试验共设6 个处理，3 次重复，共18 个小区：①不添加任何材料对照(CK)；②施用腐熟秸秆(S)；③施用腐熟秸秆+木本泥炭(SP)；④施用腐熟秸秆+木本泥炭+商用激发剂-I(SPJ1)；⑤施用腐熟秸秆+木本泥炭+商用激发剂- Ⅱ(SPJ2)；⑥施用腐熟秸秆+木本泥炭+商用激发剂-III(SPJ3)。腐熟秸秆、木本泥炭、激发剂仅2016 年插秧前施用一次，2017 年开始仅常规秸秆还田。小区面积为0.062 hm2，长41.5 m，宽15 m，所有处理随机排列。腐熟秸秆还田量为2 998.5 kg/hm2，购自江阴市联业生物科技有限公司；木本泥炭与激发剂均购自北京利丰高科科技有限公司，木本泥炭施用量为30.0 t/hm2，激发剂施用量1 499.3 kg/hm2。

供试作物为水稻，品种为Y 两优900。水稻种植前，施用碳铵449.8 kg/hm2，之后将土壤打糊，静止过夜后进行插秧，以30 cm(行距)× 20 cm(株距)插秧，保证小区种植密度一致。在水稻种植7 d 后，将尿素(224.9 kg/hm2)和除草剂拌匀后一并施进稻田，之后不再追肥。基肥施用纯氮总量为168.7 kg/hm2。

1.2 样品采集与测定

本试验所用样品采自2017 年水稻收获季，即考察木本泥炭和激发剂施用2 a 后水稻产量与土壤性质变化。每个试验小区内5 点取样法测产，得到产量因子值后，计算求得各小区平均产量。土样采集为每个试验小区内取表层土壤(0 ～ 20 cm)，多点采集混合而成一样品，重复3 次，然后用四分法取出足够的样品，一部分保存于4 ℃ 冰箱中用于土壤基本性质测定，一部分存于 –20 ℃ 用于土壤DNA 提取及细菌群落测定。

土壤基本性质测定参照文献[21]，土壤 pH 采用电位法测定；硝态氮(NO–3-N)采用紫外分光光度法测定；铵态氮(NH4+-N)采用靛酚蓝比色法测定；有机质(SOM)采用重铬酸钾氧化-外加热法测定；有效磷(AvaP)采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定；土壤微生物生物量碳(MBC)、氮(MBN)采用氯仿熏蒸浸提法测定，易氧化碳(EOC)采用 333 mmol/L 高锰酸钾氧化法测定，可溶性有机碳(DOC)测定采用水提取、过滤方法。团聚体采用湿筛法测定，土壤颗粒组成采用吸管法测定。土壤团聚度计算采用公式：y=[(x1–x2)/x1]×100%，式中，y为土壤团聚度，x1为＞0.05 mm 微团聚体测量值；x2为 ＞ 0.05 mm 土壤颗粒组成测量值。

土壤总 DNA 采用 Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA) 试剂盒提取。每个样品称取0.5 g 鲜土，按照说明书操作提取DNA。选取特征引物515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTA A-3′) 和 907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)16S rRNA 基因 V4 ～ V5 区进行 PCR 扩增。反应体系：Q5 聚合酶 0.25 μl，5 μl 5×Q5 反应缓冲剂，5 μl 5×Q5 GC 强化剂，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，10 μmol 正向反向引物各 1 μl，超纯无菌水 8.75 μl，DNA 模板2 μl。反应条件：98 ℃ 预变性 2 min，98 ℃ 变性 60 s，55 ℃ 退火 60 s，72 ℃ 延伸 30 s，26 个循环之后，72 ℃ 延伸 5 min。反应产物采用 QIA quick PCR Purification kit (Qiagen) 进行纯化。将不同样品的PCR 扩增产物等摩尔混合后，采用 Illumina 公司MiSeq 测序仪完成序列分析。

1.3 数据处理及统计方法

利用 QIIME(quantitative insight into microbial ecology)软件进行微生物数据处理，相似度为97%的序列合并为同一可操作分类单元(OTU)，结果采用RDP(ribosomal database project) 方法与Green-Genes 数据库进行物种比对(置信度80%)，鉴定微生物群落组成并计算 α-多样性指数(observed species，Chao1 和PD whole tree)。土壤基本性质数据统计分析采用SPSS 17.0 软件，LSD 多重比较，微生物数据分析采用R 软件，绘图采用Origin 2016。

2 结果

2.1 水稻产量

各处理水稻产量如图1。S 处理产量与CK 相似，而SP、SPJ1、SPJ2、SPJ3 处理分别比CK 增产9.3%、15.9%、11.5%、18.8%，与单施秸秆或不施用任何有机物料CK 相比，施用木本泥炭有提高水稻产量趋势，其中SPJ1、SPJ3 处理增产达到统计学上显著差异。表明，在SP 处理基础上添加激发剂Ⅰ、 Ⅲ 能显著提高作物产量，增产效果优于激发剂Ⅱ。

图1 不同处理水稻产量Fig. 1 Crop yields under different treatments

2.2 土壤性质

2.2.1 土壤有机质及其易利用部分 由表1 知，SP、SPJ1、SPJ2、SPJ3 处理间SOM、EOC、DOC结果相似，并在所有处理中属最高水平，其中SOM值比S 和CK 处理分别增加20.6%、12.1%、18.8%、20.6% 和39.3%%、29.5%、37.3%、39.3%，EOC 较S 和CK 处理分别增加124.6%、95.5%、104.1%、123.1% 和48.9%、29.9%、35.3%、47.9%，而DOC仅比S 处理显著增加67.2%、52.7%、50.8%、75.5%。尽管SP 处理的MBC 含量显著高于添加激发剂的3个处理(SPJ1、SPJ2、SPJ3)，但添加木本泥炭处理均显著高于其余处理，SP、SPJ1、SPJ2、SPJ3 处理分别比S 和CK 处理高13.5 倍、10.9 倍、10.5 倍、11.3倍和16.1 倍、13.0 倍、12.5 倍、13.4 倍。SPJ3 处理的MBN 值显著高于其他处理，而其余处理间无显著性差异。上述结果导致S 处理的MBC/MBN 值与CK类似，而SP、SPJ1、SPJ2、SPJ3 处理MBC/MBN 值分别是S 和CK 处理的12.4 倍、10.6 倍、8.3 倍、5.1倍。相关分析表示，EOC 和MBC 呈显著正相关(图2)，表明施用木本泥炭有刺激微生物生长趋势，而微生物的迅速繁殖反过来又可促进活性有机质的累积。

表1 不同处理下稻田土壤有机质及易利用部分Table 1 Organic matter and its easy-to-use fractions in paddy soils under different treatments

2.2.2 土壤pH 及速效养分 表2 表示，S 与SPJ1处理的pH 类似，但显著低于其他处理。除SPJ1 处理显著提高了土壤NO–3-N 含量，SP、SPJ3 处理显著降低土壤NH4+-N 含量外，其余处理速效氮含量未有明显变化。本试验选择的3 种激发剂施用均显著增加了土壤AvaP 含量，而不同激发剂之间没有显著差异，CK、S、SP 处理间也没有显著差异，施用激发剂处理(SPJ1、SPJ2、SPJ3)的AvaP 含量比SP、S、CK 处理提高了63.9% ～ 91.7%、46.2% ～ 70.9%、44.7% ～ 69.3%。

表2 不同处理下稻田土壤pH 及速效养分Table 2 Soil pH and available nutrients in paddy soils under different treatments

2.2.3 土壤团聚度 由表 3 可知，与 CK 相比，S、SPJ1 处理 ＞0.25 mm 团聚体含量分别提高了0.9%、5.6%，SP、SPJ2、SPJ3 处理 ＞0.25 mm 团聚体含量分别降低 4.2%、3.6%、5.0%，但均未达到显著性差异。图 3 表示，本试验条件下土壤团聚度分为显著不同的两组：施用激发剂组和不施用激发剂组，组内结果类似，但施用激发剂组比不施用激发剂组团聚度显著提高，SPJ1、SPJ2、SPJ3 团聚度较 SP显著提高了 28.8%、43.6%、26.4%。表明施用激发剂显著改善了微团聚体水稳性，而不同激发剂之间没有显著差异。

表3 不同处理下稻田土壤团聚体组成(%)Table 3 Composition of soil aggregates in paddy soils under different treatments

2.3 土壤细菌多样性与群落组成变化

2.3.1 细菌多样性 高通量测序结果经质量控制后每个样品均获得16 836 条高质量序列，经比对后归并为1 255 个OTU，归属于385 个属，264 个科，197 个目，105 个纲以及36 个门。α-多样性指数是表征样品内部多样性以及均匀度指数，以Shannon 指数表征细菌多样性，PD_ whole_ tree(PD)指数表征细菌系统发育多样性。结果发现(图4A)：单一秸秆还田降低了土壤细菌多样性以及系统发育程度，而配施木本泥炭后细菌多样性与系统发育程度均不同程度提高，施用激发剂后细菌多样性处于较高水平。相关性分析发现，细菌多样性指数与DOC、细菌系统发育多样性指数与EOC 显著正相关，表明施用木本泥炭以及激发剂后，DOC、EOC 含量的增加是土壤细菌多样性与系统发育程度提高的主要原因。

图3 不同处理下稻田土壤团聚度Fig. 3 Aggregation degrees of paddy soils under different treatments

图4 不同处理下稻田土壤细菌群落α 多样性变化(A)、Shannon 指数与DOC 之间关系(B)、PD 指数与EOC 之间关系(C)Fig. 4 α-diversity of bacterial community (A), relationship between Shannon index and DOC (B), relationship between PD index and EOC (C)in paddy soils under different treatments

2.3.2 细菌群落组成及其与环境因子关系 图5A表示，Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi 是稻田土壤中优势物种，相对丰度分别为41.95%、19.17%、14.78%。Actinobacteria(5.34%)、Firmicutes (2.85%)、Gemmatimonadetes(2.54%)、Planctomycetes (2.43%)、Nitrospirae(1.59%)、Cyanobacteria(2.02%)、Bacteroidetes(1.42%)是其余相对丰度大于1% 的物种。对不同处理细菌群落进行PCoA 分析如图5B。结果发现：主坐标前两轴解释了群落变异的44.95%，S、SPJ1 处理与其余处理沿第一轴分开，CK、SP 处理与其余处理在第二轴上分开。Anosim 分析结果也说明，添加外源有机物料处理(S、SP)与CK 群落结构差异显著(R2=0.75，P= 0.005)，同时施用激发剂处理(SPJ1、SPJ2、SPJ3)群落结构与SP 处理也具有显著差异(R2= 0.44，P= 0.001)。上述分析表明有机物料与激发剂的添加能显著影响土壤细菌群落组成，改变群落结构。

为明确不同处理下土壤环境因子间关系以及其对于土壤细菌群落结构分异的影响，基于Bray-Curtis距离算法，将土壤环境因子拟合到不同处理的非度量多维尺度(NMDS)排序图上。胁强系数用以反映降维过程中数据失真水平，其值越小，表明图中空间关系越能准确表征数据信息。由Stress = 0.12 可知，该排序分析结果能解释不同处理间群落分异与环境变量关系88% 的信息(图6)。与图5B 结果类似，SPJ1、SPJ2、SPJ3 处理位于第一轴下方，而其他处理均位于第一轴上方，表示施用激发剂处理的土壤细菌群落组成与其他处理差异显著，这差异主要与AvaP、MBN、EOC、DOC 有关(图6)。

图5 不同处理下稻田土壤细菌群落组成变化Fig. 5 Changes of bacterial community composition in paddy soils under different treatments

图6 不同处理下稻田土壤细菌群落结构与土壤性质之间关系Fig. 6 Relationship between bacterial community structure and soil properties under different treatments

3 讨论

本研究采用高通量测序技术，研究了不同外源有机物料添加对稻田土壤性质的影响以及细菌群落响应。结果表明，不同外源有机物料造成土壤理化性质差异，从而影响作物产量以及细菌群落多样性和结构。

3.1 有机物料还田配施激发剂对土壤理化性质、水稻产量的影响

木本泥炭含碳量高，作为一种重要的腐殖酸资源，是制作有机肥料的优质原料。秸秆也常作为重要的有机物料，用于还田以改善土壤质量。大量研究表明，添加有机物料能改善土壤理化性质，从而提升土壤肥力，促进作物增产[23-25]。本研究中，与CK 相比，秸秆还田(S)、秸秆还田+木本泥炭(SP)、秸秆还田+木本泥炭+激发剂(SPJ1 ～ SPJ3)均有效提高土壤有机质含量，其中SP、SPJ1 ～ SPJ3 处理能显著提高易氧化碳(EOC)、可溶性有机碳(DOC)、微生物生物量碳(MBC)等土壤活性有机质部分，SPJ1 ～ SPJ3 处理对土壤AvaP、团聚度有显著提升作用。就作物产量而言，S 处理未能有效提高作物产量，这可能是由于秸秆的高C/N 比，微生物在分解过程中会从土壤中吸收矿质氮固定在体内，与作物争夺有限营养，引起负激发效应[16]；也可能是由于秸秆还田未能提高土壤活性有机质含量(表1)，土壤有机碳含量高低仅说明有机质数量并不能直接说明其质量[26]，而活性有机质是土壤中易被分解转换、活跃度高的部分，也是微生物活动能源和土壤养分的驱动力[27]。本研究发现EOC 与MBC 均呈良好的线性关系(图2)，表明施用木本泥炭提高EOC 含量，能有效刺激微生物生长，进而可能提高作物生长所需的养分循环转化。木本泥炭由于其复杂结构，能有效吸附铵，从而减少氮素挥发提高氮素利用率[28]，也能通过同晶置换提高土壤中磷的有效性[29]，有明显增产作用。这与王亚彪等[30]在甘蔗上应用木本泥炭研究结果一致。秸秆还田配施木本泥炭既补充了土壤中碳源，也增加了土壤氮素的持续供应能力[31]；激发剂的添加提高了土壤有效磷(AvaP)含量以及团聚度(图3)，为微生物提供良好生存环境，提高农作物对养分利用率，加速土壤中养分物质循环过程[32]，促进作物高产，其中激发剂Ⅰ、Ⅲ效果更优。

3.2 有机物料还田配施激发剂对土壤细菌多样性的影响

土壤微生物群落参与有机质分解和腐殖质形成分解过程，是土壤中物质转换和养分循环中重要一环[33]，多样性指数是评价土壤的微生物群落多样性非常有效的方法之一。袁红朝等[34]利用 T-RELP 和定量 PCR 技术研究了长期不同施肥对红壤性水稻土细菌多样性的影响，结果发现，施肥处理(氮磷钾配施和秸秆还田)土壤细菌多样性均高于不施肥处理。郭梨锦等[35]采用PLFA 方法也发现秸秆还田显著提高表层稻田土壤微生物多样性。本研究结果显示外源有机物料对稻田土壤细菌多样性产生了影响(图 4)。与 CK 相比，秸秆还田(S)细菌多样性有所降低，可能是土壤性质改变增加了某些优势种群数量，而相应减少了其余细菌种类和数量，从而细菌多样性降低。SP、SPJ1 ～ SPJ3 处理提高了土壤细菌多样性指数和系统发育指数。相关性分析表明 DOC 与 Shannon 指数、EOC 与 PD 指数均显著正相关(图 4)，表示施用木本泥炭与激发剂后，DOC、EOC 含量的增加可能是土壤细菌多样性与系统发育程度提高的主要原因。

3.3 有机物料还田配施激发剂对土壤细菌群落结构的影响

施肥作为影响土壤肥力最主要的农业措施之一，对于土壤微生物群落组成、结构也具有重要调节作用[36-37]。袁红朝等[22]研究了长期施肥对土壤细菌组成影响，结果发现 Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi 为稻田土壤主要细菌类群。王霞等[38]利用克隆文库技术发现不施肥和秸秆还田的稻田土壤中优势菌种均为 Proteobacteria，秸秆还田后Proteobacteria 相对丰度提高了 5%。本研究与上述研究结论一致，Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi 是稻田土壤中优势种群(图5A)。

PcoA 与 Anosim 分析结果表明有机物料还田和配施激发剂能显著改变土壤细菌群落结构，土壤微生物群落结构与土壤理化性质密切相关。刘琼等[39]利用 T-RFLP 技术通过培养试验发现，土壤pH、SOC对水稻土中具有碳同化功能的微生物群落结构有显著影响。张敬智等[40]研究发现淹水能提高土壤 DOC含量，加速土壤微生物对碳源的利用，从而影响群落结构。陈晓芬等[41]采用 PLFA 技术研究长期不同磷肥处理对红壤水稻土微生物群落影响，结果发现有效磷、有机碳是影响群落结构和功能多样性的关键因素。本研究利用非度量多维尺度排序(NMDS)分析发现，pH 和 AvaP 是影响土壤细菌群落的最主要环境因子，施用激发剂处理与其余处理群落差异还受MBN、EOC、DOC 的影响，与上述研究结论一致。

4 结论

1)秸秆还田配施木本泥炭和激发剂较不施肥和单一秸秆还田处理显著提高了土壤有机质及其活性部分(EOC、DOC、MBC)，作物增产9.3% ～ 18.8%。外源有机物料配施激发剂进一步显著提高了土壤团聚度和AvaP 含量。

2)秸秆还田基础上配施木本泥炭和激发剂后，土壤EOC、DOC 含量的增加提高了细菌多样性和系统发育程度。Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi是稻田土壤优势菌种。本试验施用的3 种激发剂均显著改变了细菌的群落组成，其改变与土壤性质AvaP、MBN、EOC、DOC 显著相关。表明激发剂可以通过改变微生物的群落结构，从而有可能改变其功能，最后导致土壤理化性质的改善。