基于鱼明胶分散体系SeNPs制备及其抗氧化性研究

都鹏程 - 王 辉 胡月明 - 涂宗财,2,3 -,2,3

(1. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2. 江西师范大学国家淡水鱼加工技术研发专业中心，江西 南昌 330022；3. 江西师范大学江西省淡水鱼高值化利用工程技术研究中心，江西 南昌 330022)

硒作为必需微量元素，与人体生理功能密切相关，如构成体内谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶的活性中心[1-3]，还具有预防心血管疾病、抗衰老、抗病毒等作用[4]。单质硒是一种生物惰性硒，无生物毒性和生物活性[5]。张劲松等[6-7]发现硒颗粒在纳米尺寸状态下表现出较高的生物活性和较低的生物毒性。研究表明，粒径<500 nm的红色硒纳米颗粒(Selenium nanoparticles, SeNPs)在生物传感器[8]、纳米医学领域如抗菌[9]、抗氧化[10]、抑癌[11-12]等方面均表现出优异特性。

目前，利用还原法制备SeNPs，其分散体系的选择很大程度上决定了SeNPs的尺寸大小及稳定性。蛋白质(牛血清白蛋白)[13]、多糖(阿拉伯胶、海藻多糖)[14-15]等物质可作为分散体系制备合适尺寸的SeNPs。而鱼明胶作为不同水解程度的胶原蛋白混合物，不仅具有蛋白质作为制备SeNPs分散体系所需特性，还具有优异的凝胶性、稳定性、成膜性等加工特性。试验拟选用鱼明胶作为分散体系，利用还原法制备SeNPs，并采取动态光散射法、扫描电镜等手段探究SeNPs粒径大小、形貌特征，抗氧化活性以及消化稳定性，以期为SeNPs制备提供新的分散体系，为其产业化以及应用提供技术和理论指导依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

抗坏血酸(VC)、亚硒酸、DPPH、ABTS：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

透析袋(3 000 Da)、邻苯三酚、Tris-HCl、EDTA-Na2：分析纯，北京索莱宝科技有限公司；

鱼明胶：美国Sigma公司。

1.1.2 主要仪器设备

酶标仪：Synergy H1型，美国伯腾仪器有限公司；

粒度仪：Nano ZS90型，英国马尔文仪器有限公司；

扫描电镜： Regulus8100型，日本日立公司；

冻干机：LGJ-1D-80型，北京亚泰科技仪器技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 纳米硒制备 分别向鱼明胶水溶液加入0.5，1.0，1.5，2.0 mL浓度为0.2 mol/L的亚硒酸溶液，混匀，加入3倍于亚硒酸体积的0.2 mol/L VC溶液，用蒸馏水定容至8 mL，混匀，使鱼明胶分散体系浓度分别为2.000%，1.000%，0.500%，0.125%，常温反应2 h，透析袋透析72 h，冷冻干燥，备用。

1.2.2 SeNPs粒径测定及形貌表征

(1) 粒径测定：将冻干后的SeNPs配置成30 mg/mL溶液，利用超声波使其充分溶解后备用。取5 μL溶液，稀释10 000倍后测定。扫描次数3次，单次扫描时间13 s，单次扫描重复15次。

(2) 形貌表征：取5 μL质量分数为30 mg/mL的SeNPs溶液稀释20 000倍，取10 μL稀释液滴于洁净的硅片上，自然干燥，喷金后置于扫描电镜下进行形貌表征。加速电压5 000 V，发射电流9.6 μA。

1.2.3 SeNPs体外抗氧化能力测定

(1) DPPH自由基清除能力：根据Xie等[16]的方法稍作修改。利用70%乙醇配制浓度为0.25 mmol/L的DPPH溶液，吸取DPPH溶液300 μL，分别加入30 mg/mL的SeNPs溶液0，5，10，15，20，25 μL，用蒸馏水定容至325 μL，于暗处反应30 min，离心，测定517 nm处吸光值。以VC、谷胱甘肽为阳性对照，亚硒酸为阴性对照。按式(1)计算DPPH自由基清除能力。

(1)

式中：

DC——DPPH自由基清除能力，%；

As——样品与DPPH溶液混合后的吸光值；

AC——样品与70%乙醇混合后的吸光值；

Ab——DPPH与水混合后的吸光值。

(2) ABTS自由基清除能力：根据郑善元等[17]的方法稍作修改。配制7.4 mmol/L ABTS溶液以及2.6 mmol/L过硫酸钾溶液，等比混合，室温避光反应16 h，用70%乙醇溶液稀释至734 nm处的吸光值为0.75左右，备用。吸取ABTS溶液300 μL，分别加入30 mg/mL的SeNPs溶液0，2，4，6，8，10 μL，用蒸馏水定容至310 μL，室温反应10 min，测定734 nm处吸光值，按式(2)计算ABTS自由基清除能力。

(2)

式中：

AC——ABTS自由基清除能力，%；

A0——水取代样品测得的吸光值；

As——样品与ABTS溶液反应后的吸光值。

(3) 还原力：根据Yen等[18]的方法稍作修改。各取200 μL 1%铁氰化钾溶液和磷酸盐缓冲溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)于试管中，分别加入30 mg/mL的SeNPs溶液0，5，10，15，20，25 μL，用蒸馏水定容至425 μL，50 ℃水浴20 min，再加入10%三氯乙酸溶液200 μL，混匀，3 000 r/min离心5 min。吸取200 μL上清液，加入200 μL蒸馏水以及40 μL 0.1%三氯化铁溶液，室温反应2 min，测定700 nm处吸光值。

(4) 超氧阴离子清除能力：根据郭雪峰等[19]的方法稍作修改。取236 μL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5，含2 mmol/L EDTANa2)置于96孔板中，分别加入3 mg/mL的SeNPs溶液4 μL，混匀，再迅速加入10 μL 1.2 mmol/mL邻苯三酚溶液(pH 2.4，1 mmol/L HCl 溶解)，使反应体系SeNPs浓度为48 μg/mL，持续测定319 nm处吸光值，每40 s测定一次，共10 min。以水为空白对照，VC、谷胱甘肽为阳性对照，亚硒酸为阴性对照。

1.2.4 消化稳定性测定 以1.000%，0.500%，0.125%鱼明胶分散体系制备的SeNPs为样品，分别记为1，2，3，进行体外模拟消化。采用粒度仪测定其在胃肠模拟消化过程中的粒径变化，其中胃消化用G表示，肠消化用I表示。G-0、G-1分别表示样品模拟胃消化0，1 h；G+I-0、G+I-1、G+I-2分别表示经胃消化1 h样品模拟肠消化0，1，2 h。

1.2.5 数据处理 结果以“平均值±标准偏差”表示，利用SPSS 21.0，Origin 9.0以及CS 5软件对数据、图像进行处理。

2 结果与分析

2.1 SeNPs粒径及形貌分析

由表1可知，SeNPs在溶液中均具有较小的粒径分布系数(PDI值，PDI<0.3)，即SeNPs在溶液中有较高的分散度[20]。随着鱼明胶浓度的升高或降低，SeNPs的平均粒径均增大，但其平均粒径始终<100 nm(处于77～90 nm)，说明鱼明胶可作为SeNPs制备过程中良好的分散体系，使其在溶液中分散均匀。Zhang等[21]利用牛血清白蛋白(BSA)作为SeNPs分散体系，增加BSA的浓度在一定程度上有利于更小的硒颗粒的生成；Jia等[22]利用多糖提取物为分散体系制备SeNPs，发现硒颗粒粒径大小会随着多糖含量的增加而减小。此外，改变鱼明胶浓度或亚硒酸浓度对SeNPs粒径有一定影响，但其尺寸始终<500 nm，处于具有生物活性范围内。因此，利用鱼明胶作为SeNPs制备过程中分散体系，具有较高的可操作性，其制备过程中，SeNPs粒径大小受物料浓度影响小，可使得制备的SeNPs具有均一性、稳定性。

表1 亚硒酸含量对鱼明胶分散体体系的SeNPs粒径分布的影响Table 1 Effects of selenite content on the size distribution of SeNPs in fish gelatin dispersion System

鱼明胶分散体系制备的SeNPs在溶液中均呈透明稳定的红色胶体状态，而不含鱼明胶的分散体系的硒颗粒经反应后快速团聚并沉淀于容器底部。由图1可知，鱼明胶分散体系制备的SeNPs均为大小均一的球形颗粒，且尺寸均为73 nm左右，说明鱼明胶是良好的制备SeNPs的分散体系，可有效防止生成的SeNPs团聚沉淀，且制备的SeNPs均为球形，形貌、粒径大小不受鱼明胶体分散体系浓度影响。而此处测定SeNPs粒径大小与动态光散射法测定SeNPs存在差异，可能是由于溶液中包裹SeNPs的鱼明胶具有一定厚度，导致其整体粒径测定值偏大。

2.2 SeNPs体外抗氧化能力

2.2.1 DPPH自由基清除能力 由图2可知，SeNPs的DPPH自由基清除能力低于VC、谷胱甘肽等强还原剂，但仍表现出较强的DPPH自由基清除能力，而亚硒酸水溶液表现出较弱的DPPH自由基清除能力。不同浓度鱼明胶分散体系制备的SeNPs溶液DPPH自由基清除能力表现出较大的差异(清除能力为1.000%鱼明胶体系<0.500%鱼明胶体系<0.125%鱼明胶体系)，但其自由基清除能力均随SeNPs溶液浓度的增高而增大。其中，1.000%，0.500%鱼明胶分散体系的SeNPs自由基清除IC50值分别为1.846 0，0.923 0 mg/mL。当0.125%鱼明胶分散体系制备的SeNPs溶液浓度为0.461 5 mg/mL时，DPPH自由基清除率达(58.316±0.323)%，说明SeNPs具有良好的DPPH自由基清除能力。不同浓度鱼明胶分散体系制备的SeNPs溶液DPPH自由基清除能力可能与制备的SeNPs溶液中SeNPs绝对含量有关，反应体系鱼明胶浓度越低，SeNPs绝对含量越高，DPPH自由基清除能力越强。

图1 SeNPs的扫描电镜图Figure 1 SEM images of SeNPs

2.2.2 ABTS自由基清除能力 由图3可知，亚硒酸、VC以及谷胱甘肽都具有极强的ABTS自由基清除能力。而不同浓度鱼明胶体系制备的SeNPs也表现出较强的ABTS自由基清除能力，其清除能力为1.000%鱼明胶体系<0.500%鱼明胶体系<0.125%鱼明胶体系，其中1.000%，

图2 SeNPs的DPPH自由基清除能力Figure 2 DPPH clearance ability of SeNPs

图3 SeNPs的ABTS自由基清除能力Figure 3 ABTS clearance ability of SeNPs

0.500%，0.125%鱼明胶体系制备的SeNPs清除ABTS自由基IC50值分别为0.580 0，0.387 1，<0.193 5 mg/mL，说明SeNPs具有较强的ABTS自由基清除能力，且制备过程中鱼明胶浓度越低其清除能力越强，与DPPH自由基清除能力结果一致。

2.2.3 还原力 由图4可知，亚硒酸无还原能力，VC以及谷胱甘肽均具有强还原力，SeNPs具有较强的还原能力，且随SeNPs浓度的增加而增大。其中0.125%鱼明胶体系制备SeNPs的还原力显著高于0.500%，1.000%鱼明胶体系的。说明不同鱼明胶体系制备的SeNPs还原力大小仅与溶液中SeNPs的绝对含量有关，反应体系鱼明胶浓度越低，SeNPs绝对含量越高，其还原力越大。

图4 SeNPs的还原力Figure 4 Reducing power of SeNPs

2.2.4 超氧阴离子清除能力 由图5可知，当反应时间为2.5～9.5 min时，邻苯三酚自氧化监测曲线呈良好的线性关系，其曲线斜率代表了反应体系中邻苯三酚自氧化速率，表明除VC具有一定羟基自由基清除能力外，其他样品均能在一定程度上促进羟基自由基的产生。其中亚硒酸促进羟基自由基产生的程度显著高于其他试验组，3种体系制备的SeNPs促进羟基自由基产生的能力无显著差异，但是体系中SeNPs含量越高，其自氧化速率越快。这可能是硒元素在体内代谢过程中产生羟基自由基或其他形式的活性氧，从而对机体产生氧化损伤。综上，SeNPs可促进羟基自由基的产生，加速邻苯三酚自氧化速率，但SeNPs的促进程度又显著低于亚硒酸，说明其生物毒性低于亚硒酸。

图5 SeNPs的羟基自由基清除能力测定Figure 5 Determination of clearance ability of SeNPs

2.3 SeNPs消化稳定性

由图6可知，加入胃液后，SeNPs尺寸分布主要集中于220 nm以上，而其平均粒径增加至850 nm左右；胃消化过程中，SeNPs尺寸继续增加，而经胃消化1 h后的硒颗粒溶液充分分散后，在模拟肠消化过程中，聚集的SeNPs又重新回到纳米尺寸，均匀地分散于溶液中。此时，SeNPs粒径尺寸分布主要集中于105 nm以下，平均粒径<100 nm，且体系鱼明胶含量越少， SeNPs平均粒径越小。综上，胃消化过程会使SeNPs聚集乃至形成沉淀，但该沉淀仅为简单堆积，在肠消化过程中聚集状态的SeNPs重新分散，拥有纳米尺寸，表现出良好的消化稳定性。研究[23-24]表明，肠黏膜只能阻断>1 mm的颗粒，而纳米硒颗粒可通过毛细血管深入组织。经肠消化后SeNPs尺寸均<100 nm，说明SeNPs可能成为硒补充剂从而被机体消化吸收。

3 结论

采用鱼明胶作为制备SeNPs的分散体系，并对其粒径、形貌、抗氧化性、消化稳定性进行研究。结果表明，鱼明胶可作为SeNPs制备过程中良好的分散体系，制备出的SeNPs受物料分散体系浓度影响小，呈球形，且尺寸<100 nm，并具有优异的体外抗氧化能力，且与SeNPs的绝对含量呈正比。此外，SeNPs在静态模拟消化过程中表现出良好的消化稳定性。但研究仅对SeNPs体外相关性质进行了探索，后续可继续采用细胞模型、动物模型开展SeNPs细胞抗氧化活性、细胞毒性、体内吸收机制以及SeNPs生理活性相关研究，进一步为SeNPs可能成为新型硒补充剂提供理论指导和数据支撑。

图6 SeNPs在模拟胃肠消化过程中的粒径变化图Figure 6 Changes in particle size of SeNPs during gastrointestinal digestion