基于LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞炎症模型的榴莲壳多酚抗炎作用及其分子机制

刘文强 - 张懿玲 - 熊 华 朱雪梅 - 孙 永

(1. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 333047；2. 江西中医药大学， 江西 南昌 330004；3. 大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034)

炎症是机体受到损伤或有害刺激后产生的一种适应性反应[1]，与许多疾病的发展联系密切，包括肝硬化、癌症、糖尿病和动脉粥样硬化等慢性疾病[2-3]。许多化学合成药物已被用于预防或治疗炎症，如非甾体抗炎药物(NSAID)，但这些药物通常有副作用，如肝毒性、肾病、消化性溃疡、腹泻、呕吐，并对机体健康产生伤害。研究[4-6]表明，水果中的一些功能性成分能够抑制或缓解机体炎症，且无毒副作用。而水果中丰富的多酚类化合物，因其具有优良的抗氧化活性，能够清除生物体内大量的活性氧自由基，从而预防疾病的发生[7-8]。

榴莲(DuriozibethinusMurr.)是东南亚最受欢迎的热带水果之一，具有极高的营养价值[9-10]和独特的口感风味，由于其外观类似于亚洲国王的荆棘而被称为“热带水果之王”[10-12]。榴莲果肉和果壳都含有丰富的生物活性化合物，如花青素、类胡萝卜素、多酚、黄酮等[13-15]。Kanthimathi等[16]研究表明榴莲富含多酚和黄酮化合物，且对一氧化氮诱导的MCF-7细胞增殖具有保护作用。冯健英等[17]发现从榴莲中分离出的酚类物质具有显著的NO抑制活性。此外，榴莲内皮提取物也具有抗炎活性，能显著抑制LPS(脂多糖)诱导RAW 264.7细胞所产生的 NO和炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的释放[18]。目前的研究多集中于榴莲果肉、内皮，而关于榴莲壳的研究相对较少。Na等[9, 14]发现榴莲壳提取物对 DPPH和ABTS自由基具有较高的清除率，且与多酚含量有关。Ho等[19]发现榴莲壳提取物具有抗糖尿病、降血脂、抗增殖活性和抗菌活性。但有关榴莲壳多酚的抗炎作用及其分子机制的研究尚未见报道。试验拟通过测定榴莲壳提取物的总酚、总黄酮含量和抗氧化活性，并基于LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型，探究榴莲壳多酚的抗炎作用及其分子机制，旨在为其综合利用和开发新型功能性食品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

ABTS试剂盒、FRAP试剂盒、DCFH-DA：中国碧云天生物技术研究所；

四甲基偶氮唑盐(MTT)、氨卡青霉素/链霉素、 Trolox、二甲基亚砜(DMSO)、 RNA提取试剂盒：美国 Sigma 公司；

丙酮酸钠、DAEM完全培养基：美国 Gibco 公司；

小鼠巨噬细胞系RAW 264.7：中国科学院(上海)细胞库；

蛋白Marker：全式金生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

超净工作台：CB 800 H型，苏州净化设备工程有限公司；

酶标仪：MK3型，美国 Thermo仪器有限公司；

CO2细胞培养箱：CP-ST200A型，长锦科技有限公司；

荧光定量PCR仪：CFX96型，美国BIO-RAD公司；

化学发光成像系统：ChemiDoc XRS型，美国BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 榴莲壳提取物的制备 取干净的榴莲壳洗净，分离为榴莲内壳(白色内果壳，也称榴莲皮)和榴莲外壳(黄色外果壳)，冷冻干燥，超微粉碎，过60目筛。称取榴莲壳粉末20 g，按料液比1∶30 (g/mL)加入80%甲醇，40 ℃、超声功率200 W超声20 min，收集上清液，重复3次。上清液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得粗提物[榴莲内壳提取物(DPE)和榴莲外壳提取物(DSE)]。粗提物过Oasis®HLB 6cc (200 mg)纯化柱后冷冻干燥，于-80 ℃冷冻备用。

1.3.2 总多酚、总黄酮含量测量 参照Sun等[20]的方法。

1.3.3 体外抗氧化活力测定

(1) DPPH自由基清除能力：参照Sun等[20]的方法。

(2) ABTS自由基清除能力：参照试剂盒说明书。

(3) Fe3+还原/抗氧化能力(FRAP)：参照试剂盒说明书。

1.3.4 细胞培养 小鼠巨噬细胞系RAW 264.7在含有10% FBS胎牛血清、1%双抗(链霉素100 mg/mL、青霉素100 U/mL)和90% DMEM完全培养基中培养。待细胞长满培养瓶后，按体积比1∶3的稀释比对细胞进行传代培养。

1.3.5 细胞活力测试 在96孔板中加入8×103个/孔对数期生长的RAW 264.7细胞，37 ℃，5% CO2条件下孵育过夜。加入不同浓度的DPE (0～500 μg/mL) 和DSE (0～500 μg/mL) 处理24 h，每孔中加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，培养箱内避光孵育4 h后丢弃上层培养基，加入100 μL DMSO溶解甲醛染料，避光震荡10 min，用酶标仪于492 nm测定处吸光度。

1.3.6 榴莲壳提取物对LPS诱导的RAW 264.7细胞NO分泌量的影响 在96孔板中加入8×103个/孔对数期生长的RAW 264.7细胞，37 ℃，5% CO2条件下孵育过夜。加入不同浓度的DPE (10，25，50 μg/mL) 和DSE (10，50，100 μg/mL) 处理2 h，加入终浓度为1 μg/mL的脂多糖(LPS)溶液，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。培养结束后，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，收集上清液，参照一氧化氮(NO)试剂盒说明书，在96孔板中加入50 μL上清液后，加入50 μL Griess A，震荡1 min，加入Griess B继续反应10 min，于540 nm处测定吸光度值，用NaNO2建立标准曲线，计算样品中亚硝酸钠浓度，从而推算各组细胞培养液中NO含量。

1.3.7 榴莲壳提取物对LPS诱导的RAW 264.7细胞 ROS的影响 参照1.2.6对细胞进行处理，培养结束后，在黑暗条件下加入终浓度为100 μmol/L的2’, 7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光试剂，避光反应30 min后，以激发波长488 nm、发射波长 525 nm 的条件，用荧光酶标仪对细胞中的平均荧光强度进行测定。

1.3.8 榴莲壳提取物对炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10分泌量的影响 按1.3.6对细胞进行处理，参照酶联免疫吸附剂(ELISA)试剂盒说明书对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)的分泌量进行测定，根据标准曲线，计算各种炎症因子的含量。

1.3.9 实时定量PCR 在6孔板中加入5×105个/孔对数期生长的RAW 264.7细胞，37 ℃，5% CO2条件下孵育过夜。加入不同浓度的DPE(10，25，50 μg/mL)和DSE(10，50，100 μg/mL)处理2 h，加入终浓度为1 μg/mL的LPS溶液，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。培养结束后，4 ℃、2 000 r/min离心5 min，去上清液，冰浴条件下收集细胞。用RNA提取试剂盒提取总RNA，分装后置于-80 ℃保存备用。引物信息如表1所示，使用CFX96 RT-PCR检测系统进行检测。

表1 基因的引物表Table 1 Related information for the primers

1.3.10 免疫印迹分析 在6孔板中加入5×105个/孔对数生长期的RAW 264.7细胞，37 ℃，5% CO2条件下孵育过夜。加入不同浓度的DPE (50 μg/mL)和DSE (50 μg/mL)处理2 h，加入终浓度为1 μg/mL的LPS溶液，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。培养结束后， 4 ℃、2 000 r/min离心5 min，去上清液，冰浴条件下收集细胞。向收集的细胞内分别加入50 μL的RIPA细胞裂解液，4 ℃裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心2 min，收集上清液，使用BCA蛋白试剂盒测量蛋白质浓度。参照Miao等[1]的方法，利用化学发光成像系统测量iNOS、COX-2、IκB-α、p-IκB-α、p-p65、p65、GAPDH蛋白条带，以GAPDH为标准对条带进行量化。

1.3.11 统计分析 每个样品平行测定3次，结果以(均值±标准偏差)表示。数据采用SPSS 19.0统计学软件进行ANOVA因素。*表示与正常组(NC)相比存在显著性差异(P<0.05)，**表示与正常组(NC)相比存在极显著性差异(P<0.01)；#表示与模型组(LPS)相比存在显著性差异(P<0.05)，##表示与模型组(LPS)相比存在极显著性差异(P<0.01)。

2 结果与分析

2.1 总酚、总黄酮和体外抗氧化活性

由表2可知，DPE的总酚、总黄酮含量分别为(135.52±4.25) mg GAE/g·DW，(56.79±0.73) mg CAE/g·DW，而DSE的总酚、总黄酮含量分别为(101.06±3.36) mg GAE/g·DW，(12.91±0.03) mg CAE/g·DW。结果表明，榴莲的内皮和外壳都含有丰富的酚类成分。Cui等[21]发现槲皮素能抑制LPS诱导的巨噬细胞肿瘤坏死因子的产生，Limtrakul等[22]发现原花青素可以抑制LPS诱导RAW 264.7细胞炎症模型中的NO、IL-6、COX-2和iNOS的产生。此外，榴莲内皮提取物在LPS(脂多糖)诱导的小鼠RAW 264.7细胞模型中能显著抑制NO的产生，同时抑制炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的释放，从而展现出显著的抗炎活性[18]。

由表2还可知，榴莲壳内皮和外壳均表现出较强的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和Fe3+金属离子螯合能力，说明榴莲壳提取物具有显著的抗氧化活性，且可能与其多酚含量有关[23-24]。因此，榴莲壳可以作为抗氧化剂的优良来源，用以预防机体的氧化损伤。此外，氧化应激与机体炎症密切相关，巨噬细胞在炎症反应过程中会产生大量的自由基离子(NO、ROS)诱导细胞产生氧化应激[25-26]。

2.2 细胞活力分析

由图1可知，DPE、DSE分别在10～50，10～100 μg/mL浓度下对RAW 264.7细胞增殖没有明显抑制效果。因此，选择DPE (10，25，50 μg/mL) 和DSE (10，50，100 μg/mL) 作为后续试验的浓度梯度。

表2 榴莲壳提取物的总酚、总黄酮含量和抗氧化活性Table 2 Main antioxidant components and antioxidant activities in durian extract

图1 榴莲壳提取物对RAW 264.7巨噬细胞活力的影响Figure 1 Effect of the durian hull extract on cellviability in RAW 264.7 macrophages

2.3 榴莲壳提取物对LPS诱导的RAW 264.7细胞NO和ROS的影响

由图2可知，模型组的NO和ROS释放量显著高于对照组(P<0.01)，表明造模成功。与模型组相比，各浓度DPE和DSE处理均能显著降低NO和ROS释放量(P<0.01)，且呈浓度依赖性。据报道[16]，榴莲壳提取物能显著降低细胞内NO含量，且与其所含的多酚类化合物有关。

2.4 榴莲壳提取物对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症因子TNF-α 、IL-1β 和IL-6的影响

由图3可知，各浓度DPE和DSE处理后 IL-1β表达量分别为85.01～93.27，84.47～88.81 pg/mL，而IL-6的表达量分别为198.13～240.71，173.65～237.30 pg/mL。与模型组相比，DPE和DSE处理对IL-1β和IL-6的表达均具有显著的抑制作用；当浓度为50 μg/mL时，DPE和DSE处理对TNF-α才表现出明显的抑制效果。据报道[27]，榴莲壳提取物处理对IL-6和IL-1β的抑制效果比TNF-α更敏感，与试验结果相符。各浓度DPE和DSE处理对TNF-αmRNA表达的抑制率分别为38.87%～49.01%，34.25%～48.89%；对IL-1βmRNA表达的抑制率分别为59.24%～77.53%，54.78%～70.96%；对IL-6 mRNA表达的抑制率分别为51.62%～67.34%，50.17%～58.14%。结果表明，DPE和DSE处理对TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达具有很强的抑制作用，可能与其所含的多酚类化合物有关。综上，DPE和DSE处理对细胞炎症因子均有抑制作用(P<0.01)，表明榴莲壳提取物能在蛋白表达和基因转录水平上抑制细胞炎症因子的表达，降低机体炎症反应，从而发挥抗炎作用。

2.5 榴莲壳提取物对LPS诱导的RAW 264.7细胞iNOS和COX-2的影响

由图4可知，模型组显著提高了iNOS和COX-2 mRNA的表达量(P<0.01)。当处理浓度为50 μg/mL时，DSE对iNOS和COX-2 mRNA的抑制率分别为57.25%，32.98%，DPE对iNOS和COX-2 mRNA的抑制率分别为53.81%，30.40%。与模型组相比，DPE和DSE处理对iNOS和COX-2 mRNA的表达均表现出明显的抑制效果(P<0.01)。与模型组相比，当处理浓度为50 μg/mL时，DSE对iNOS和COX-2蛋白的抑制率分别为18.99%，24.34%，而DPE对iNOS和COX-2蛋白的抑制率分别为11.11%，16.50%。综上，DSE和DPE在基因和蛋白水平上均对iNOS 和COX-2的表达有显著的抑制效果(P<0.01)。据报道[28]，iNOS 和COX-2的表达与NF-κB信号通路密切相关。

2.6 榴莲壳提取物对LPS诱导的RAW 264.7细胞NF-κB 信号通路的影响

由图5可知，随着LPS的刺激，模型组的IκB-α快速磷酸化，导致p-IκB-α的表达水平显著升高(P<0.01)。当处理浓度为50 μg/mL时，DPE和DSE处理可显著抑制IκB-α的磷酸化。LPS处理诱导p65的磷酸化水平显著上升(P<0.01)，而DPE和DSE处理可显著抑制其磷酸化水平。结果表明，DPE和DSE处理能降低IκB-α和p65的磷酸化水平，从而抑制NF-κB信号通路的激活与表达，为其抗炎活性内在的分子机制。

NC： 空白对照组；LPS： 1 μg/mL LPS处理组；DPE: 不同浓度DPE处理组；DSE: 不同浓度DSE处理组图2 榴莲壳提取物对RAW 264.7巨噬细胞表达的影响Figure 2 Effect of the durian hull extract on NO production and ROS expression in RAW 264.7 macrophages

NC： 空白对照组；LPS： 1 μg/mL LPS处理组；DPE: 不同浓度DPE处理组；DSE: 不同浓度DSE处理组图3 榴莲壳提取物对RAW 264.7巨噬细胞产生的炎症因子表达的影响Figure 3 Effect of the durian hull extract on the inflammatory factors expression in RAW 264.7 macrophages

NC： 空白对照组；LPS： 1 μg/mL LPS处理组；DPE: 不同浓度DPE处理组；DSE: 不同浓度DSE处理组图4 榴莲壳提取物对RAW 264.7巨噬细胞mRNA和蛋白表达的影响Figure 4 Effect of the durian hull extract on mRNA and protein expression in RAW 264.7 macrophages

NC： 空白对照组；LPS： 1 μg/mL LPS处理组；DPE: 50 μg/mL DPE处理组；DSE: 50 μg/mL DSE处理组图5 榴莲壳提取物对RAW 264.7巨噬细胞NF-κB信号通路的影响Figure 5 Effect of durian shell extract of NF-κB signaling pathway in RAW 264.7 macrophages

3 结论

基于体外化学和细胞炎症模型，探究了榴莲壳提取物的总酚、总黄酮含量、抗氧化和抗炎症活性及其内在的分子机制。结果表明，榴莲壳提取物含有丰富的多酚类物质，表现出较强的体外抗氧化能力，且能有效抑制NO和ROS的生成，发挥抗氧化作用，从而减少机体的氧化损伤。榴莲壳提取物能在蛋白和基因两个层次上显著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2等炎症因子的表达，发挥抗炎活性，而其内在的分子机制可能是通过抑制NF-κB信号通路相关蛋白IκB-α和p65的降解和磷酸化。试验仅初步探讨了榴莲壳提取物的体外抗炎活性及其分子机制，而有关其多酚类成分的结构表征，其在体内外的吸收代谢规律及体内抗炎机制值得深入研究。