猪TNNC1基因和TNNC2基因在 肌肉组织中的发育性表达研究

杨冠青 刘娟 杨阳 蔡春波 赵燕 郭晓红 曹果清

摘  要：为了探明肌钙蛋白不同亚型在肌纤维增殖与类型转变上的作用和分子机理，本研究采用荧光定量PCR技术检测了TNNC1基因和TNNC2基因在25日龄、70日龄和150日龄三个生长阶段的大白猪和山西黑猪的背最长肌、腰肌和股肌中的表达变化。结果表明：这两种基因在大白猪和山西黑猪的三种肌肉组织中均有表达，但存在统计学意义上的极显著差异。TNNC1基因在大白猪的背最长肌和腰肌中的表达存在相似的变化趋势。在大白猪上，TNNC1基因在25日龄时的背最长肌和腰肌中表达量最高，在150日龄时的表达量降到最低水平;在山西黑猪上，TNNC1基因在25日龄时的股肌组织中表达量较低，而在70日龄时的腰肌、70日龄时的股肌组织、150日龄时的股肌组织中表达量最高。在大白猪上，TNNC2基因在25日龄时的背最长肌和150日龄时的股肌中表达量较高;在山西黑猪上，TNNC2基因在70日龄时的腰肌和股肌中表达量较高。说明TNNC1基因与TNNC2基因在肌纤维发育与分化过程中具有重要的调节作用，可作为检测肌纤维类型的分子标记，为探索猪的肌肉发育和改善肉品质的研究提供理论参考。

关键词：猪;肌钙蛋白C亚型1;肌钙蛋白C亚型2;骨骼肌;基因表达

肉猪生产是我国畜牧业的中坚产业，加快肉猪产业的发展对推进畜牧业的发展、增加农民收入以及推动社会进步有着重要的影响。我国的肉猪出栏量居世界之首，但生猪生产力还处于比较低的水平。近年来，随着人们生活水平的不断提高，消费者對猪肉的品质及风味的要求也越来越高。畜禽肉品质的评价指标包括嫩度、色泽、风味及多汁性等。消费者一直把嫩度作为肉质评价最主要的指标[1]。嫩度以切割肌纤维阻力的大小来判断。影响肉质嫩度的因素有很多，如肌纤维的直径、肉品质、饲喂方式、胴体的储存方式以及胴体不同部位的组织等[2-3]。

肌钙蛋白（Troponin，Tn）为钙离子结合蛋白多基因家族的成员，在细胞器转运和肌肉收缩等多个细胞进程中都起着关键作用。肌钙蛋白能够抑制Ca2+浓度，与肌球蛋白共同调节钙离子对肌动蛋白ATP酶的活性。肌钙蛋白有3个亚单位，即肌钙蛋白C、肌钙蛋白I以及肌钙蛋白T[4]。脊椎动物有两种亚型的肌钙蛋白：慢收缩亚型[Troponin C type 1 （slow），TNNC1]和快收缩亚型[Troponin C type 2 （fast），TNNC2][5]。TNNC2表达于快收缩骨骼肌，而TNNC1表达于慢收缩骨骼肌和心肌[6]。TNNC2被钙离子激活于N-末端的低亲和力钙离子结合位点Ⅰ和高亲和力钙离子结合位点Ⅱ，而TNNC1仅在高亲和力的钙离子结合位点Ⅱ处与钙离子结合[7]。田兴国通过RT-PCR分析发现TNNC2基因仅在猪的骨骼肌（如肱二头肌、股四头肌和背最长肌）中表达，在其他组织中不表达或者低水平表达，该基因对骨骼肌的生长、成肌细胞的分化以及肌肉的收缩起着重要的作用[8]。

新山西黑猪是由马身猪、内江猪、巴克夏猪和杜洛克猪经复杂的杂交选育而育成的品种，与大白猪、长白猪和杜洛克猪等国外品种相比，具有产仔数多、肉品质好以及抗逆性强等优点。本研究选择25日龄、70日龄和150日龄三个不同生长阶段的大白猪和山西黑猪为研究对象，采用qPCR技术分析TNNC1基因和TNNC2基因在两个猪种的肌肉组织中的表达差异，为研究猪肌肉发育的分子机理提供理论参考。

1  材料

1.1 试验动物

本研究以大白猪和新山西黑猪为试验动物，试验猪统一饲养于山西省乡宁县永新康生态养殖有限公司。

1.2 主要试验仪器

Mx 7500P 实时荧光定量PCR仪（美国Stratagene公司），PCR扩增仪（型号：AB9902，美国BIO-RAD公司），超净工作台（型号：BCM-1000，苏州安泰公司），ND-1000微量核酸蛋白测定仪（美国），MLS-3020高温全自动蒸汽灭菌器（型号：MLS-3020，日本三洋公司），HERMLET 10型匀浆机（美国），微型台式冷冻离心机（型号：Z233MK-2，德国）;DYY-6C型电泳仪（北京），凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司），制冰机（型号：SIM-F124，日本三洋公司），超低温冰箱（型号：FOMA700，美国）。

1.3 主要试验试剂

Trizol（美国）;cDNA第一链合成试剂盒：PrimeScript? RT-PCR Kit（Takara公司）;实时荧光定量PCR试剂盒：SYBR? PremixEx Taq? II Kit（日本Takara公司）。乙醇和异戊醇等常规生化试剂均为分析纯。

2  方法

2.1 样本采集

分别在试验猪25日龄（断奶）、70日龄（保育期结束）和150日龄（快速生长期）各屠宰4头猪（公猪和母猪各2头），摘取背最长肌、腰肌和股肌的肌肉组织，放入液氮中保存待用。

2.2 引物设计与合成

根据NCBI genbank中猪TNNC1基因和TNNC2基因的mRNA信息，以18S为内参基因，应用Primer 5以及Oligo等软件设计引物，引物委托上海生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

2.3 qPCR反应体系及反应条件优化

根据SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit试剂盒说明书建议的反应条件，以反转录合成的第一链cDNA进行常规梯度PCR扩增，分别筛选内参基因和目的基因引物的最佳退火温度和cDNA模板浓度，确定引物退火温度后进行实时PCR检测相应引物扩增熔解曲线、目的基因和内参基因的扩增效率。

2.4 数据处理

将RT-PCR所得的数据导入到EXCEL表格中，采用2-ΔΔCt法计算每个基因的相对表达量，使用SPSS 统计软件对数据进行处理与分析，同一品种不同组织或不同时间点之间的基因表达差异采用单因素方差分析，选用邓肯法进行多重比较;不同品种同一组织的基因表达变化采用独立样本t检验进行。使用GraphPad软件绘制图表。

3  结果

3.1 实时荧光定量PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，电泳图中的条带整齐，无拖尾现象，长度符合，证明所提取的RNA具有高度的完整性与稳定性，可用于后续的试验操作，结果如图1所示。

3.2 TNNC1基因在两猪种肌肉组织中的发育性表达检测结果

图2为TNNC1基因在三个不同日龄大白猪和山西黑猪中的表达趋势检测结果。试验中，以25日龄大白猪腰肌中TNNC1基因的表达值作为对照，采用2—ΔΔCt方法计算该基因在不同日龄的猪的三种肌肉组织中的相对表达量。

图2中“①图”显示了TNNC1基因在背最长肌中的相对表达检测结果。由该图可知，TNNC1基因在大白猪背最长肌中的表达量随猪日龄的增大呈下降趋势，在山西黑猪中的表达量呈现较稳定的趋势。在大白猪上，TNNC1基因在25日龄的表达量极显著高于70日龄和150日龄的，150日龄的表达量最低，极显著低于70日龄的（P<0.01）。TNNC1基因在25日龄和70日龄的大白猪中的表达量极显著高于山西黑猪的，但在150日龄，山西黑猪的表达量显著高于大白猪的。

图2中“②图”显示了TNNC1基因在腰肌中的相对表达检测结果。由该图可知，TNNC1基因在大白猪腰肌中的表达量随猪日龄的增长呈下降趋势，在山西黑猪上的表达趋势为先增后减。在大白猪上，TNNC1基因的表达趋势与背最长肌的表达趋势一致，25日龄最高，70日龄次之，150日龄最低;在山西黑猪上，TNNC1基因在70日龄的表达量极显著高于25日龄和150日龄的（P<0.01）。25日龄时，TNNC1基因在大白猪上的表达量显著高于山西黑猪的;而在生长后期（70日龄和150日龄），该基因在山西黑猪上的表达量极显著高于大白猪的（P<0.01）。

图2中“③图”显示了TNNC1基因在股肌中的相对表达检测结果。由该图可知，在大白猪上，TNNC1基因在猪生长的中前期高水平表达，150上日龄时的表达量极显著下降;然而，在山西黑猪上，TNNC1基因的表达情况则相反，在猪生长前期（25日龄）表达量极显著低于70日龄和        150日龄时的。在三个采样点比较两个猪种的TNNC1基因的表达量后发现，试验猪  25日龄时，该基因在山西黑猪上的表达量显著低于在大白猪上的（P<0.01）;70日龄时，该基因在两猪种股肌中的表达量无显著差异（P>0.05）;150日龄时，该基因在山西黑猪上的表达量显著高于在大白猪上的（P<0.05）。

3.3 TNNC2基因在两猪种肌肉组织中的发育性表达检测结果

图3为TNNC2基因在三个不同日龄大白猪和山西黑猪的表达趋势检测结果。试验中，以25日齡大白猪腰肌中TNNC2基因的表达值作为对照，采用2—ΔΔCt方法计算该基因在不同日龄的猪的三种肌肉组织中的相对表达量。

图3中“①图”显示了TNNC2基因在猪背最长肌中的相对表达检测结果。由该图可知，TNNC2基因在大白猪背最长肌中的表达量随猪日龄的增长呈下降趋势，在山西黑猪上的表达趋势为生长前期（25日龄和70日龄）的表达量极显著低于生长后期（150日龄）的。在大白猪上，TNNC2基因在25日龄时的表达量最高，极显著高于70日龄和150日龄时的，其中150日龄时的表达量最低，且极显著低于70日龄时的（P<0.01）。TNNC2基因在25日龄和70日龄时的大白猪的表达量极显著高于山西黑猪的，但150日龄时在山西黑猪上的表达量高于大白猪的。

图3中“②图”显示了TNNC2基因在猪腰肌中的相对表达检测结果。由该图可知，TNNC2基因在大白猪腰肌中的表达呈现比较稳定的趋势，在山西黑猪上的表达呈先增后减的趋势。在大白猪上，TNNC2基因的表达量在25日龄时达到最高水平，在     70日龄和150日龄时较低;在山西黑猪上，TNNC2基因在70日龄时的表达量极显著高于25日龄和150日龄时的（P<0.01）。25日龄时，TNNC2基因在大白猪上的表达量显著高于在山西黑猪上的，而在猪生长中后期（70日龄和150日龄），TNNC2基因的表达情况转变为在山西黑猪上的表达极显著高于在大白猪上的（P<0.01）。

图3中“③图”显示了TNNC2基因在猪股肌中的相对表达量检测结果。由该图可知，在大白猪上，TNNC2基因在猪生长的中前期（25日龄和70日龄）呈现低水平表达，而在150日龄时表达量极显著升高;在山西黑猪上，该基因在猪生长前期        （25日龄）的表达量极显著低于70日龄和150日龄时的。在三个采样点比较TNNC2基因在两个猪种上的表达量后发现：25日龄时，该基因在大白猪上的表达量显著高于在山西黑猪上的（P<0.01）;而70日龄时，该基因在大白猪上的表达量极显著低于在山西黑猪上的;150日龄时，该基因在大白猪和山西黑猪的股肌中的表达量无显著差异（P>0.05）。

4  讨论与结论

早期研究表明TNNC1基因仅在心肌和慢收缩性的骨骼肌中表达，而TNNC2基因只存在快速收缩性骨骼肌中[9]。但是，本试验发现TNNC1基因在不同猪种各年龄段的不同肌肉组织中均有表达，但在腰肌中的表达量最高，股肌中的最低，说明腰肌含有较高水平的慢肌纤维，而股肌含有较小比例的慢肌纤维。Parmacek和Leiden的研究表明，猪TNNC1基因只在慢肌和心肌中表达，不会在脑、肺、肝、肾或者睾丸中表达[10]。本研究发现猪TNNC1基因在背最长肌、腰肌与股肌中的表达趋势存在差异，表明TNNC1可作为检测不同类型肌纤维的分子标志。

TNNC2基因能够促进猪的肌细胞分化和骨骼肌生长[6]，被普遍认为是肉质性状的潜在候选基因[11]。TNNC2基因的等位基因T能显著影响猪肉的嫩度和大理石纹，建议将等位基因T作为选育的分子标记应用于猪的肉质选育。由于TNNC2基因通常不在心室肌细胞中表达，但在一些疾病中能够检测到该基因的异常表达，因此可将TNNC2基因作为心脏疾病预测的标记[12]。在无脊椎动物中，肌钙蛋白在肝脏、胰脏、坐骨神经、肺和眼等多个组织器官中均有表达[13]。对蓝塘猪和杜洛克猪肌钙蛋白C进行半定量分析发现该基因只在眼肌、肱二头肌和股四头肌中表达[14]。在本研究中，TNNC2基因在猪的背最长肌、腰肌和股肌中均有表达，而且在大白猪的背最长肌和山西黑猪的腰肌中表达量最高，这与田兴国等的研究结果不一致[14]。

本试验分析了TNNC1基因和TNNC2基因在不同日龄的大白猪和山西黑猪的三种肌肉组织中的表达差异，结果表明这两个基因在不同肌肉中的表达量上存在统计学意义上的极显著差异，因此它们可作为检测肌纤维类型的分子标记，为探索猪的肌肉发育和改善肉品质的研究提供理论参考。