CTRP9在糖尿病视网膜病变病程进展中的表达及其意义*

王芃萱，刘勤，白惠玲，张书，苏萌，朱晓燕

（1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR），是糖尿病常见并发症之一，主要因高血糖导致视网膜毛细血管壁渗漏等视网膜损伤引起患者视力下降［1］。有研究显示，随着世界糖尿病患者人数的增加，DR患者的数量估计到2030将增加到1.91亿［2］，巨大的患病人数给我国人民身体健康及视力预后带来了极大的危害［3］。由脂肪组织分泌的脂肪因子中如瘦素、白介素-6、超敏C反应蛋白等许多成员都能够通过调节胰岛素抵抗、氧化应激等方式参与DR的发病过程［4］。在科技与医疗的发展下，C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9（CTRP9）于2009年被Wong等［5］发现，并与脂肪因子家族中的脂联素（adiponectin，APN）有着高度同源性，在2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）、脂质代谢异常、冠心病等疾病的发生发展中有着重要作用［6-8］，是近几年所发现的最具价值的脂肪细胞因子，但CTRP9是否也参与DR的发病过程，目前相关研究还比较少。因此本研究通过构建DR动物模型，探讨CTRP9在DR病程变化中的表达情况及其意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择由甘肃中医药大学实验中心提供的健康、无眼部疾患、1个月龄SPF级SD大鼠45只。单笼饲养于温度18℃～20℃，湿度50%～60%，通风干燥的SPF级动物实验室，自由饮食，每隔2 d清洗消毒笼具、饮水器具。

1.2 主要试剂

链脲佐菌素（streptozocin，STZ）购于美国Sigma公司；Trizol试剂盒购于日本Takara公司；自美国Sigma公司及abcam公司分别购得CTRP9、内参GAPDH兔抗鼠抗体。

1.3 方法

1.3.1 实验动物造模与给药方法

以相同条件适应性饲养全部大鼠1周，按照随机数字表法从中选取15只作为正常对照组。剩余所有大鼠先建立糖尿病大鼠模型：禁食12 h后，于大鼠腹腔快速注射浓度为50 mg/kg的STZ，注射时间为3 d，并采用高糖高脂饲料进行喂养。3 d后抽取大鼠尾静脉血测血糖，结果显示血糖大于16.7 mmol/L，尿糖达到3到4个“+”且持续观察一周，发现大鼠出现生长缓慢等糖尿病表现即糖尿病模型造模成功。实验后续每7 d监测血糖一次，保留其中血糖大于16.7 mmol/L且稳定大鼠，实验过程中3只大鼠血糖低于标准已排除，用以保障3月后所有糖尿病模型组大鼠DR造模成功。将DR成模大鼠随机分为DR 5周组（5W组）及DR 10周组（10W组），每组均为15只，分别继续饲养5周及10周。正常对照组大鼠在DR组造模同时给予腹腔注射同等剂量的柠檬酸缓冲液，3 d后测空腹血糖，行普通饲料喂养。此过程中剔除死亡鼠，其中，5W组死亡1只、10W组死亡3只大鼠。

1.3.2 HE染色观察视网膜超微结构改变

各组实验大鼠随机选取2只腹腔注射10%水合氯醛麻醉过量处死，立即摘取双眼眼球，小心去掉眼前节组织，分离视网膜，使用不同浓度酒精作为脱水剂逐次脱水，石蜡包埋。固定蜡块后切片，片厚4μm，置于载玻片上烤干，经苏木精及伊红分别染色后脱水、脱色及封闭后在显微镜下对各组大鼠视网膜结构进行观察。

1.3.3 RT-PCR法检测大鼠视网膜CTRP9 mRNA表达水平

自每组中随机选择三只大鼠，采用10%水合氯醛进行大鼠麻醉过量处死，迅速取下双眼眼球，对视网膜组织进行分离，并存放入液氮中进行打碎。依据Trizol说明书，通过在冰上操作提取视网膜总RNA，经检测发现总RNA未被DNA及其他杂质污染，取3μL总RNA进行逆转录，引物委托Takara公司合成。引物序列：CTRP9 上游：5，-TTCACGGGCTTCCTTCTGTT-3，，下游：5，-AGTCACATCCTACCCTCACCAAG-3，。β-actin上游：5，-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3，，下游：5，-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3，。PCR循环程序：预变性95℃1 min，变性95℃30 s，退火59℃30 s，延伸72℃45 s，共28个循环；72℃7 min结束反应。

1.3.4 Western blot检测CTRP9蛋白表达水平

剩余大鼠同上方法处死、摘取眼球、分离得视网膜组织，使用TBST和蒸馏水反复冲洗，根据裂解液配比按每30 mg加入450μL RIPA裂解液充分裂解视网膜组织，将视网膜置于冰上小心剪碎、充分匀浆EP管中的组织，匀浆液离心2次，每次各10 min，温度及转速为4℃、12 000 r/min。取含有蛋白质的上清液，检测蛋白浓度并进行蛋白定量保证等质量上样。配制10%SDSPAGE胶上样30μg，转膜，封闭，加入一抗于室温微摇1 h后4℃冰箱静置过夜，用TBST置于摇床洗涤3次（10 min），与二抗室温微摇2 h，同上方法洗膜3次后于将膜上加入发光液显影，目的蛋白的相对表达量用目的条带与内参GAPDH条带的灰度值之比表示。

1.4 统计学分析

该项研究选择SPSS 25.0软件处理，计量资料以（G±S）表示，并实施t检验与单因素方差分析，如经计算P＜0.05说明有统计学意义。

图1 各组大鼠视网膜HE染色（×400）

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜组织HE染色表现

对照组大鼠视网膜组织未发现显著的病理性变化（图1A）；DR 5W组大鼠视网膜结构出现个别细胞水肿（图1B黑色箭头处），内核层部分区域细胞排列疏松；DR 10W组视网膜组织明显水肿，神经上皮层可见增生的毛细血管，内、外核层排列紊乱，毛细血管明显扩张，腔内可见红细胞，结构组织疏松肿胀并出现层间偶伴融和（图1C黑色箭头处）。

2.2 各组大鼠视网膜组织中CTRP9 mRNA表达水平

DR组大鼠视网膜CTRP9 mRNA表达对比正常组水平降低（P＜0.05）；与5W组比较，10W组大鼠视网膜CTRP9 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。如图2所示及表1所列。

图2 RT-PCR法检测各组CTRP9 mRNA表达水平柱状图

表1 各组视网膜组织中CTRP9 mRNA表达水平（xˉ±s）

2.3 各组大鼠视网膜组织CTRP9含量

Western blot检测结果与正常组比较，5W大鼠CTRP9蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与正常组比较，10W组大鼠CTRP9蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。如图3-4所示。

图3 各组大鼠视网膜组织CTRP9蛋白表达量对比

图4 各组大鼠视网膜组织CTRP9蛋白表达对比

3 讨论

DR是糖尿病晚期出现的一种并发症，已经成为导致人类失明的主要原因之一，其发病机制非常复杂，现阶段还无法予以明确。DR早期病理改变主要为毛细血管周细胞丢失、基底膜增厚及微血管瘤产生［9］，随着DR病程的延长，血-视网膜屏障功能破坏、毛细血管闭塞伴随新生血管及纤维组织生成增多，视网膜结构的损伤程度越发严重［10］。本实验视网膜HE染色结果显示大鼠视网膜组织的病变随着DR大鼠饲养期延长而越发严重，其中10W组组织水肿最明显、各层之间细胞排列紊乱，提示本实验造模成功。近年来研究发现脂肪组织作为胰岛素的靶器官，其分泌的脂肪因子调控异常与肥胖、T2DM等代谢性疾病的发病有着密切的联系［11］，APN是脂肪细胞因子中的重要组成部分，在T2DW与并发症病情控制方面存在显著意义［12］。新生血管的生成对DR患者视网膜组织通常造成较大的损伤，对视力也有较大影响，研究发现APN通过激活血管内皮细胞中的氧化氮合酶，使NO含量增高，从而减轻新生血管对视网膜组织的损伤［13-14］。临床研究也显示，在DR病程的各个分期，APN水平均明显低于对照组［15］，当患者血清APN水平降低时，其血管内皮舒张功能受限，从而对DR患者的视网膜微血管造成损伤［16-17］。CTRP9与APN的化学结构类似，研究发现CTRP9也可提高外周组织对葡萄糖的摄取，显著降低血糖浓度［6］，且在T2DM患者的血液中CTRP9与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α ，TNF-α）的浓度呈负相关，通过二甲双胍治疗后血浆CTRP9浓度上升，说明CTRP9与T2DM的发病有相关性［7-8］。CTRP9作为近年来新发现的脂肪因子，与APN有着类似的生理作用，APN能够通过多种方式减轻DR对视网膜组织的损伤，但近年来关于CTRP9对在DR发病中所起作用的研究还较少，因此探究CTRP9对DR的保护作用对DR的早期诊断、治疗有着重要意义。

本研究中，RT-PCR及Western blot结果显示CTRP9的mRNA及蛋白表达在5W组及10W组较正常组均明显减少（P＜0.05），且10W组蛋白表达量最少，提示正常视网膜组织中CTRP9含量高、DR视网膜组织中含量低且随病情的加重而减少。既往关于CTRP9在T2DM发病中的研究显示，将胰岛素分别注入到不同小鼠体内，经一段时间后可了解，实验组小鼠的肝脏内胰岛素激活的Akt通路受到抑制，其胰岛素的浓度有所增加，实验组与对照组的对比中，可了解到口服糖耐量试验过程中小鼠体内胰岛素含量有所减少，由此表明CTRP9可通过减轻胰岛素抵抗情况降低小鼠血糖浓度，从而对T2DM有着保护作用［6］。还有研究显示，CTRP9可使T2DM小鼠促进氧化应激反应的细胞因子表达下降，如CTRP9能够抑制超氧化物歧化酶的生成，从而延缓肥胖与T2DM的发生发展［18］，因此本实验在大鼠糖尿病模型造模成功后继续饲养5周及10周，模拟DR的发病过程，探究CTRP9在DR不同病程中的表达情况，实验结果提示CTRP9与DR的发病呈负相关，且其表达水平随着DR病程的进展持续减少。过去对CTRP9与DR发病及氧化应激反应的研究中显示，同样作为一种具有抗氧化功能的蛋白，硫氧还蛋白（thiore⁃doxin，Trx）能够提升人视网膜色素上皮的抗氧化应激能力，对视网膜有着保护作用，经过外源性Trx腹腔注射治疗后，治疗组大鼠视网膜组织内CTRP9含量与DR模型组CTRP9表达明显增多，提示Trx促进CTRP9的表达从而减轻了DR氧化应激反应对视网膜的损害作用［19］。还有研究显示在db/db小鼠体内静脉注射表达CTRP9的腺病毒载体后，CTRP9可抑制db/db小鼠视网膜中的多种炎症因子的表达。此外，CTRP9还能防止db/db小鼠血视网膜屏障的断裂和紧密连接蛋白的下调，能显著减轻DR早期血管渗漏的状况，从而通过多种方式抑制DR的炎症反应［20］。临床研究也显示与正常对照组比较，DR患者血清CTRP9及其同家族的CTRP3水平均降低，表明两者水平下降与糖尿病发生存在相关性［21］。本实验关于CTRP9在DR大鼠中的表达降低的结果与既往研究相符，但由于本实验样本量较少且对于DR病程进展的观察时间较短，在更长的DR病程中CTRP9将如何变化以及在DR病程中CTRP9通过何种途径参与DR的发病还需进更加深入的研究。

综上所述，CTRP9与DR的发病相关，且随着DR病情的加重，CTRP9的含量随之减少，提示DR患者体内CTRP9减少，可能伴有DR病情进展，补充或调节体内CTRP9合成分泌，增加CTRP9的表达水平，有望成为防治DR的新干预措施。