基于共轭物的酸性水解——利用萃取-衍生化-GC/MS分析人尿中17-酮类固醇

高 原

(中国刑事警察学院，辽宁 沈阳 110854)

在犯罪调查取证中，尿液是重要的检材。但在犯罪现场上，不能确定尿液来源于受害者或者案发相关人，需要对尿液的来源进行判定。因此人和动物的尿液鉴定，在刑事科学方面很重要。以前的人尿证明是通过尿酸检测来进行的。但尿酸有时不能成为人尿的证明指标，因为鸟类的粪便中含有尿酸，犬类中的达尔马提亚狗也会在尿液中排泄尿酸[1]。因此我们认为，对人尿中17-酮类固醇(17-KS)的雄酮(A-n)、本胆烷醇酮(Eti)、脱氢表雄酮(DHEA)的检验是一种能够有效鉴定人和动物尿液的方法[2]。

对于刑事科学检验中的17-KS分析，主要有GC-MS法与LC-MS法。而相较于LC-MS，GC-MS的设备更易操作，且市面上的质谱库也很丰富，因此通过GC-MS进行的尿中17-KS分析虽然需要花费时间进行水解和衍生化反应，但仍可以说是一种更为实用的分析方法。

尿中17-KS共轭物的水解可以通过酶法和酸法进行。酶法水解反应特异性强，但反应时间长且费用高。而酸法水解反应时间短且费用低，并且未见关于17-KS共轭物的酸性水解的研究报告。所以，本实验以人尿为样品，对用于GC-MS分析的17-KS共轭物的酸性水解条件进行研究。另外，本实验通过GC-MS分析中常用的衍生化方法，将萃取物干燥后进行反应。有报告提到了使用七氟丁酰氯(HFB-Cl)同时进行衍生化和萃取的萃取-衍生化法[3-4]。而这些报告介绍了在固相萃取时向洗脱液内添加衍生化试剂的方法，没有研究其在液-液萃取中的应用。因此，本实验对该方法能否应用于液-液萃取进行了验证。

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

An、Eti、DHEA、DHEA的硫酸共轭物和葡萄糖醛酸共轭物标准品(Sigma公司)，含有1%三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)(SPELCO公司)，HFB-Cl(Aldrich公司)，七氟丁酸酐(HFBA)(Pierce公司)。

5名健康成年男性(年龄25～55岁)和3名健康成年女性(年龄25～50岁)提供的0.2ml尿液施放到1×1cm的棉布上制成的尿斑。

GC检测器(Thermo Fisher Scientific公司)，DB -5MS(30m×0.25mm ID，膜厚0.25μm)，质谱检测器(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 酸性水解条件的研究

在制成的尿斑上加1mL蒸馏水，超声处理5min，在500μL的提取液中加入500μL盐酸，使其最终浓度达到1.5%,3%,7%。将含有不同浓度盐酸的提取液在60℃、80℃、100℃下加热20min进行水解。然后，将市售浓盐酸浓度设为36%，计算出盐酸浓度。通过对反应时间10,20,30,40,50,60min进行研究，得到An、Eti和DHEA共轭物的最佳水解时间。水解后，在反应液中加入氨水进行中和，用2mL氯仿萃取2次。使用无水硫酸钠将萃取液脱水后进行减压蒸发干燥，对萃取物中的17-KS进行TMS衍生化和GC-MS分析。进行TMS衍生化时，在干燥的氯仿萃取物中加入含有1%三甲基氯硅烷的50μl三氟乙酰胺(BSTFA)，用铝制加热器在70℃下反应30分钟。将反应液冷却到室温(约25℃)后，测量水解后产生的An量、Eti量和DHEA量。在所有条件下进行5次实验，计算出平均值和标准偏差。

1.2.2 使用HFB-Cl进行萃取-衍生化的条件研究

分别取An、Eti、DHEA的标准品各500ng，加入1mL的水制成标准品溶液，按以下条件对该溶液进行萃取-衍生化。在全部条件下实验3次，计算出平均值和标准偏差。

1.2.2.1 萃取溶剂的研究

在1mL的An、Eti和DHEA各标准品的500ng/mL水溶液中加入2mL含有5% HFB-Cl的6种溶剂(正己烷、丁基氯、甲苯、二乙醚、乙酸乙酯和氯仿)的任一种，在室温下用漩涡混合器搅拌2min。分取有机层后，在水层中再次加入2mL含有相同试剂的同种溶剂，搅拌2min。将获得的有机溶剂层调和，用无水硫酸钠进行脱水，通入氮气将溶剂蒸馏去除后，溶解到100μL的乙酸乙酯中，进行GC-MS分析。

1.2.2.2 HFB-Cl浓度的研究

为了确定衍生化试剂HFB-Cl的最佳浓度，在1mL的An、Eti和DHEA各标准品的500ng/mL水溶液中添加2mL的正己烷，使HFB-Cl的最终浓度能够达到1%,2%,3%,4%,5%,7%和10%，进行萃取-衍生化反应和GC-MS分析。

1.2.2.3 pH值的影响

为了确定反应溶液的pH值对萃取-衍生化反应效率的影响，对50mM邻苯二甲酸缓冲溶液(pH4)、100mM磷酸缓冲溶液(pH值=6和pH值=8)、10mM硼酸缓冲溶液(pH值=10)和0.1M NaOH进行稀释，将pH值调整到pH值=12，用该水溶液调配出1mL的An、Eti和DHEA各标准品的500ng/mL溶液，用含有5%HFB-Cl的2 mL正己烷进行萃取-衍生化反应和GC-MS分析。

1.2.3 HFB-Cl萃取-衍生化效率的计算

取An、Eti和DHEA各500ng，加入50μL的HFBA并进行密封，在70℃下加热30min。反应后，通入氮气将溶剂蒸馏去除，然后溶于100μL的乙酸乙酯中进行GC-MS分析。取含有等量An、Eti和DHEA的水溶液1mL，按照上述方法用HFB-Cl进行萃取-衍生化反应和GC-MS分析，用不同方法获得HFB衍生物的峰面积比，从中计算出萃取-衍生化效率。

1.2.4 检测灵敏度的研究

在标准品An、Eti和DHEA中添加1mL水调配出溶液，在确定条件下进行萃取-衍生化反应和GC-MS分析，调查检测灵敏度。以S/N比为5的浓度作为检测限。

1.3 GC-MS 条件

柱温：200℃→280℃(5℃/min)；载气：氦气(流量0.7 mL/min)；入口温度：260℃；分流比：20∶1；电离法：电子电离法；测量模式：扫描模式(检测范围m/z 50～500)。

根据TMS衍生物条件下m/z 272(An)、m/z 257(Eti)、m/z 129(DHEA)和HFB衍生物条件下m/z 442(An)、m/z 442(Eti)、m/z 270(DHEA)的各衍生物基峰面积进行定量。 HFB衍生物在该条件下的检测限：An为15ng/mL，Eti为8ng/mL，DHEA为50ng /mL。

1.4 对模拟鉴定资料的运用

按照1.2.1的方法对取自5名成年男性和3名成年女性的尿斑中含有的An、Eti和DHEA进行水解，然后按照1.2.2的方法进行分析。但水解的盐酸浓度为6%，反应温度为100℃，反应时间20分钟，HFB-Cl的浓度为5%，萃取溶剂采用了正己烷。

2 结果与分析

2.1 酸性水解条件的研究

An、Eti和DHEA各共轭物的酸性水解的温度和盐酸浓度关系如图1所示。对比盐酸浓度为1.5%和3%的情况，通过尿中An共轭物水解得到的游离An在3%条件下的生成量更多，且生成量会随着反应温度的升高而增加。但在盐酸浓度为7%的情况下，对比反应温度为60℃和80℃的情况，游离An在温度较高的80℃条件下的生成量会增加，但在100℃条件下的生成量反而比80℃时有所减少。关于Eti的水解，在盐酸浓度为1.5%、3%、7%的情况下，游离Eti的生成量都会随着反应温度的升高而增加。而另一方面，游离DHEA在60℃的水解温度条件下几乎检测不到，当温度为80℃，盐酸浓度为3%和7%时可以确认游离DHEA的生成量。当温度为100℃时，无论是何种盐酸浓度都可以确认游离DHEA的生成量，但在盐酸浓度为7%、温度为80℃的条件下游离DHEA生成量出现下降。因此，我们认为水解的有效条件是3%盐酸浓度和100℃加热温度。

图1 An、Eti和DHEA各共轭物水解产量与HCI浓度、反应温度关系图

图2 An、Eti和DHEA各共轭物水解产量与反应时间关系图

接下来，我们研究了An、Eti和DHEA共轭物在3%盐酸浓度和100℃加热温度条件下的水解时间，其结果如图2所示。可以看出，游离An量和Eti量在反应的前30min均会一直增加，在反应30min之后出现减少。另一方面，游离DHEA在反应的前20min会一直增加，然后减少。 An和DHEA的减少趋势更为明显。因此我们认为，3%的盐酸浓度、100℃的加热温度、20min的反应时间是比较适宜的。

2.2 采用HFB-Cl进行萃取-衍生化的方法研究

2.2.1 萃取溶剂的研究

实验结果表明：使用二乙醚、乙酸乙酯、氯仿检测不出衍生物。同时确认可以通过正己烷、丁基氯、甲苯进行萃取-衍生化，且使用正己烷时的萃取-衍生化效率最高。

2.2.2 HFB-Cl浓度的研究

本实验研究使用各种浓度的HFB-Cl对500ng的各成分标准品进行萃取-衍生化时发现，An的峰面积在HFB-Cl浓度达到5%之前一直增加，但之后没有观察到明显差异，Eti的峰面积在HFB-Cl浓度达到4%之前一直增加，在5%以后没有观察到明显差异。另外，DHEA的峰面积受HFB-Cl浓度的影响不大，但4%～7%左右比较适宜(图3)。综上，HFB-Cl浓度定为5%。

图3 HFB-Cl浓度对17-KS衍生化的影响

2.2.3 样品溶液的pH值的影响

将样品溶液从pH值=4调整到pH值=12，研究样品溶液的pH值对5%HFB-Cl/正己烷的萃取-衍生化的影响。发现萃取-衍生化效率在pH值=8处最高(图4)。

图4 pH值对17-KS衍生化的影响

2.3 对模拟鉴定资料的运用

用5名成年男性(年龄25岁～55岁)和3名成年女性(年龄25岁～50岁)提供的尿液制成尿斑作为模拟鉴定资料，进行17-KS分析，确认峰值处显示的保留时间和质谱同来自所有样品的标准品An、Eti和DHEA的HFB衍生物相同，分别对尿液中的An、Eti和DHEA进行类别确定。以其中1人(29岁 男性)的分析结果为例，如图5所示。

图5 人尿中17-KS的分析结果

3 结论

本实验利用GC-MS对人尿中17-酮类固醇进行分析，通过对盐酸浓度、加热温度、加热时间、衍生化试剂浓度、pH值等条件进行测试，发现在3%盐酸浓度、100℃温度、20min加热时间的条件下进行实验效果最好。同时对萃取-衍生化反应中的溶剂进行研究时发现，使用正己烷时的效率最高。另外，使用该方法对取自不同年龄和不同性别的8名成年人的尿斑进行了分析，An、Eti和DHEA这三种成分全部被检测出来。因此该方法作为人尿中17-KS分析法是有效的。