响应面法优化桃儿七鬼臼毒素的超声提取工艺

刘盈盈，李彩霞，冯海生，许显莉，马世震*

(1. 中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2. 青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室，青海 西宁 810008；3. 中国科学院大学，北京 100049)

桃儿七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying]属小檗科桃儿七属多年生草本植物，是一个分布范围较广、生态适应幅度大的物种，主要分布在喜马拉雅及邻近地区，产于云南、四川、西藏、甘肃、青海和陕西[1]，生于林下、林源湿地、灌丛中或草丛中，海拔1500～4300 m[2]。其味甘、性平，有小毒，具有活血化瘀和调经的功能，主要用于治疗血瘀、经闭和难产等[3]。桃儿七中含有多种化学成分，主要包括木脂素类和黄酮类，还有皂苷、鞣质和多糖等，其中木脂素类主要为鬼臼毒素。现代药理研究表明，桃儿七具有抗肿瘤、祛痰止咳、抗炎、抗病毒等多种作用[4]，而鬼臼毒素最显著的药理作用是抗肿瘤和抗病毒作用[5]。从桃儿七中高效提取大量鬼臼毒素具有重要意义。

目前，关于提取鬼臼毒素的研究方法有加热回流提法[6]、甲醇冷浸法[7]、超声波辅助提取法[8-12]等，其中超声波辅助提取法[13-14]优点较多。超声波提取是近年来发展起来的新型提取技术，超声波能促使植物细胞组织破壁或变形，使有效成分提取更充分，提取速度快，能耗低[15]，具有很好的提取效果。相对于冷浸法、加热回流提取法，超声波辅助提取法具有时间短、效率高等优点。因此，本研究采用超声波辅助提取法进行桃儿七鬼臼毒素提取，在单因素试验的基础上，以鬼臼毒素含量为响应因子，采用响应面法对提取过程中主要影响因素进行优化，旨在得到鬼臼毒素的最佳提取条件，然后进行验证性试验，并测定不同地区野生桃儿七根部的鬼臼毒素含量，为桃儿七中鬼臼毒素的开发利用提供科学参考。

1 仪器与试剂

1.1 试验仪器

SL-500A型高速万能粉碎机(浙江省永康市松青五金厂)；BPG-9140A型电热鼓风干燥箱(一恒科学仪器有限公司)；ML2047型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；SK3310LHC型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；Agilent Infinity 1260型高效液相色谱仪；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.2 试验药材与试剂

不同产地的桃儿七药材(见表1)；鬼臼毒素标准品(纯度≥98%，批号：17112303，成都普菲德生物技术有限公司)；乙腈(色谱纯，德国默克股份两合公司)；甲酸(色谱纯，天津市凯信化学工业有限公司)；甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司)。

表1 桃儿七样品来源

2 试验方法

2.1 鬼臼毒素标准品溶液的制备

精密称取鬼臼毒素标准品0.001 g，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.1 μg/μL的标准品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精确称取桃儿七根的干燥粉末0.1 g，粉末过40目筛，置于具塞试管中，在选定的料液比、超声时间、超声温度、以及甲醇体积分数下提取，共三次，每次30 min，抽滤得提取液并定容至10 mL的容量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜，得供试品溶液。

采用高效液相色谱法对提取液进行测定，采用下列公式计算粗提物中鬼臼毒素含量。

m：鬼臼毒素质量(g)；M：桃儿七根质量(g)

2.3 色谱条件

采用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈(A)-0.04%甲酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(表2)，流速0.5 mL/min，柱温30℃，检测波长290 nm，进样量10 μL。对照品和样品色谱图见图1。

表2 梯度洗脱的流动相比例

图1 鬼臼毒素的对照品(A)和样品(B)色谱图Fig. 1 Chromatogram of control substance (A) and sample (B) of PPT注：a为鬼臼毒素

2.4 线性关系考察

吸取2.1项下配置的标准品溶液，过0.22 μm微孔滤膜滤过，依次设定进样量为2、4、6、8、10、12、14、16 μL，按2.2.3项下的色谱条件进行测定分析。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品质量(X)为横坐标，进行线性回归。

2.5 单因素试验

2.5.1 料液比对提取效果的影响

在超声时间为10 min，超声温度为30℃，甲醇体积分数为100%的条件下，分别按照1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g∶mL)的料液比，探究不同料液比对桃儿七根中鬼臼毒素提取效果的影响。

2.5.2 超声时间对提取效果的影响

在料液比为1∶30 (g∶mL)，超声温度为30℃，甲醇体积分数为100%的条件下，分别按照5，10，15，20，25，30 min的超声时间，探究不同超声时间对桃儿七根中鬼臼毒素提取效果的影响。

2.5.3 超声温度对提取效果的影响

在料液比为1∶30 (g∶mL)，超声时间为10 min，甲醇体积分数为100%的条件下，分别按照20，30，40，50，60℃的超声温度，探究不同超声温度对桃儿七根中鬼臼毒素提取效果的影响。

2.5.4 甲醇体积分数对提取效果的影响

在料液比为1∶30 (g∶mL)，超声时间为10 min，超声温度为30℃的条件下，分别按照20%，40%，60%，80%，100%的甲醇体积分数，探究不同甲醇体积分数对桃儿七根中鬼臼毒素提取效果的影响。

2.6 响应面试验

通过对上述单因素试验的分析，选出对试验影响较大的因素，较好的水平进行响应面试验，采用Design Expert8.0统计分析软件的响应面分析法安排实验。

2.7 验证试验

为了便于工艺操作，将最优参数调整为：料液比为1∶40 (g∶mL)，超声时间为21 min，超声温度为56℃，甲醇体积分数为82%，进行三次平行提取试验。

2.8 桃儿七中鬼臼毒素含量测定

根据响应面试验得到的最优参数，对不同地区的桃儿七干燥根进行鬼臼毒素含量测定分析。

3 结果与分析

3.1 线性关系考察结果

由2.4项下得回归方程和线性范围，见表3。

表3 线性关系

3.2 单因素试验结果

由图2A可知，在温度为20℃和30℃时，鬼臼毒素含量基本无变化，但随着温度增加到60℃时，鬼臼毒素含量急剧增加，这与周艳红等人[16]的研究相似。表明温度低时，鬼臼毒素溶出较慢，所以最终温度确定为60℃。

由图2B可知，随着超声时间的延长，鬼臼毒素的含量先增后降，在超声时间为20 min时，鬼臼毒素的含量达到最大值，随着时间增加，鬼臼毒素含量则呈现下降趋势，得到与李玲等人[17]的研究相一致的结果。这可能是由于超声波辅助提取超过一定时间，提取溶剂损失量增加，鬼臼毒素的稳定性变差，同时引起其他物质溶出，使鬼臼毒素含量相对下降。所以确定超声时间为20 min时，为单因素试验的最佳条件。

由图2C可知，随着提取液的增加，鬼臼毒素含量先增加后下降，在料液比1∶40 (g∶mL)时达到最大值，再增加提取液，鬼臼毒素含量明显下降，所以确定料液比为1∶40 (g∶mL)时，为单因素试验最佳条件。

由图2D可知，随着甲醇体积分数的增加，鬼臼毒素含量先是急剧上升的趋势，然后平缓上升，直到甲醇体积分数达到80%时，鬼臼毒素含量开始下降。这与崔文燕等人[18]的研究相似，可能是由于甲醇体积分数超过适宜甲醇体积分数会增加其他物质的溶出，降低鬼臼毒素的相对含量，而且提高了投料成本，所以最终确定甲醇体积分数为80%。

3.3 响应面试验结果

3.3.1 响应面试验设计与回归模型的建立

由2.6项下得超声波提取桃儿七根中鬼臼毒素的最佳因素水平(见表4)。

表4 响应面试验因素水平

综合考虑单因素结果，响应面分析结果见表5。从表5中可以看出，料液比、超声时间、超声温度和甲醇体积分数的中心点试验值(鬼臼毒素含量)均高于析因点试验，这与单因素试验的结果相吻合，说明该响应面设计的29个试验点可信度较高。

3.3.2 回归模型的方差分析

利用Design-expert 8.0.6 软件对表5试验数据进行回归分析，得二次多元回归方程：

Y=1.52+0.021*A+0.031*B+0.025*C+0.025*D+(7.500E-003)*AB-0.022*AC-0.017*AD-0.052*BC+(2.500E-003)*BD-(5.000E-003)*CD-0.061*A2-0.051*B2-0.047*C2-0.057*D2。

表5 响应面试验数据表

从表6可知，该回归模型P<0.0001，表明该回归模型具有统计学意义，而失拟项P>0.05不显著，同时R2=0.9584与Radj2=0.9169都接近1，表明该模型的可靠程度较高，对试验的拟合度较好，从而该回归方程可代替实际值对试验结果进行分析。另外从分析结果可知，料液比、超声时间、超声温度及甲醇体积分数四个因素对鬼臼毒素含量的影响都极显著，从F值可判断，四种因素对鬼臼毒素含量的影响顺序为：超声时间(B)>超声温度(C)=甲醇体积分数(D)>料液比(A)。

表6 回归方程方差分析

注：P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著

3.3.3 两因素交互影响的响应面分析

对料液比、超声时间、超声温度及甲醇体积分数四因素进行交互作用分析，结果如图3所示。响应面可以直观的反映各试验因素对鬼臼毒素含量影响的大小，响应面的坡度越陡，说明鬼臼毒素含量对该试验因素的改变越明显；反之，坡度越缓，该因素对鬼臼毒素含量的影响越不明显。响应面在底面的投影为等高线图，等高线的性状反映了两两因素交互作用的强弱，圆形表示两两因素交互作用不显著，而椭圆表示两两因素交互作用显著。从图3中可看出，超声时间的响应面坡度最陡，超声温度和甲醇体积分数次之，料液比最缓。超声温度与超声时间的交互作用对鬼臼毒素含量的影响尤其显著，其原因主要是物料在超声辅助提取过程中，限定的超声时间和超声温度对目标化合物的提取起决定性作用[19]。通过Design Expert 软件分析，超声波辅助提取桃儿七中的鬼臼毒素最优参数为：料液比为1∶40.3 (g∶mL)，超声时间为20.86 min，超声温度为55.74℃，甲醇体积分数为81.99%，在此条件下，桃儿七中鬼臼毒素提取含量的理论值为1.53%。

3.3.4 验证试验

结果表明，在此提取条件下，鬼臼毒素的实际含量测得1.52%(n=3)，与理论值相近。说明此法具有一定的参考价值。

3.4 不同地区桃儿七中鬼臼毒素的含量结果

由表7可看出，西藏地区桃儿七中鬼臼毒素的含量最高，甘肃地区桃儿七中鬼臼毒素的含量最低，四川汶川桃儿七中鬼臼毒素含量次之，其中甘肃部分地区和四川汶川地区、湖北地区和青海玉树地区桃儿七中鬼臼毒素含量无显著差异，其余地区均有显著差异。

表7 不同地区桃儿七中鬼臼毒素含量(n=3)

Table 7 The content of PPT inS.hexandrumin different areas(n=3)

样品编号含量(%)S11.78±0.02dS20.73±0.02hS30.76±0.03hS41.32±0.02gS51.90±0.04cS61.47±0.02fS71.52±0.01fS83.87±0.01bS91.58±0.02eS104.28±0.01a

注：同列不同小写字母表示差异显著，P<0.05

4 讨论

本研究针对不同地区的桃儿七进行了含量测定，明确测定了不同地区的桃儿七中鬼臼毒素含量，得到西藏地区桃儿七中鬼臼毒素含量最高。李敏等人[20]测定了青海、西藏、四川、云南、甘肃地区的桃儿七鬼臼毒素，得出西藏的桃儿七中鬼臼毒素含量最高的结论，与本研究结论基本一致。这可能是由于西藏独特的地理位置以及气候有利于桃儿七中鬼臼毒素积累合成，也说明青藏高原地区桃儿七药材的品质相对较佳。本研究中有些地区含量高低不同的可能原因是不同产地的土壤、降水、气候等因素的影响以及采集的野生药材生长年限不同和采集月份不同导致。刘世巍等人[21]采用回流提取的方法测得桃儿七中鬼臼毒素含量为0.017%；李艳玲等人[22]用超声辅助提取法测得桃儿七中鬼臼毒素的含量为1.05%；Liu等人[23]采用真空泡状辅助溶剂萃取法测得桃儿七中鬼臼毒素的含量为2.24%。本研究采用超声辅助提取法测得不同地区的桃儿七中鬼臼毒素含量为0.74～4.18%，相对高于其他方法的提取含量，在生产实践中具有一定的参考价值，为今后桃儿七的鬼臼毒素提取分离和药材品质鉴别选择提供了科学依据和参考。

5 结论

本研究采用响应面法对桃儿七中鬼臼毒素的超声辅助提取工艺进行优化。影响桃儿七鬼臼毒素超声提取效果的主要因素包括料液比、超声时间、超声温度、甲醇体积分数。因此，选取料液比、超声时间、超声温度、甲醇体积分数为考察因素，在单因素试验的基础上，运用Box-Behnken响应面分析法对桃儿七鬼臼毒素的超声辅助提取工艺进行优化。由方差分析可知，上述4个因素对桃儿七鬼臼毒素得率的影响程度为超声时间(B)>超声温度(C)=甲醇体积分数(D)>料液比(A)。利用响应面优化后，桃儿七鬼臼毒素最佳超声辅助提取工艺为料液比1∶40.3 (g∶mL)，超声时间20.86 min，超声温度55.74℃，甲醇体积分数81.99%。通过验证试验，证明本模型工艺参数准确可靠，能够较好地预测实际情况，表明采用超声辅助提取桃儿七中鬼臼毒素切实可行，稳定性好，高效便捷。在此条件下，对不同地区的桃儿七干燥根中鬼臼毒素含量进行测定，不同产区的桃儿七鬼臼毒素含量以西藏地区市场桃儿七中鬼臼毒素的含量最高，为4.18%。因此，本研究能够为桃儿七提取物的生产提供试验依据，同时为中药材的提取工艺提供一定的理论指导。