布拉氏酵母菌对哺乳犊牛腹泻率、血清免疫、抗氧化指标及粪便微生物的影响

2020-06-11卢奇成吴妍妍张文举

饲料工业 2020年9期

卢奇成吴妍妍张文举

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000）

幼龄阶段是反刍动物一个重要的生理时期，这个阶段的生长发育与其潜在生产性能有着密切的关系。由于刚出生的犊牛胃肠道微生物及免疫系统还不够健全，哺乳期犊牛更容易发生腹泻，约占犊牛发病率的80%[1]，而且发生过腹泻的犊牛在今后的生长发育过程中还易感染呼吸道及肠道疾病[2]，对犊牛的发育、生长、成活等有很大影响，以至于会直接影响到其后期的配种以及生产性能的发挥，进而影响行业的经济效益。引起腹泻的原因有很多，比如饲养环境差、饲喂操作不固定、奶及饲料的污染等，这些不当的饲养管理导致大量外源性致病菌进入犊牛胃肠道，致病菌大量生长繁殖，致使犊牛肠道内菌群失衡，且此时犊牛的免疫功能不完善抵抗力低下，最终导致犊牛胃肠道的消化、吸收、运动机能障碍而导致中毒性腹泻[3]。

布拉氏酵母作为绿色无残留无毒副作用的益生菌，在人类临床上已经多次作为治疗腹泻的方法。布拉氏酵母将抗生素相关腹泻发生率从17.2%降至6.7%，且无副作用[4]；95 例不同年龄段旅行者腹泻患者(19～69 岁)接受布拉氏酵母治疗后，5 d 痊愈[5]；在269 例儿童患者的随机对照试验中发现，接受布拉氏酵母治疗后，显著降低了梭菌感染肠炎发生率，由17.3%降至3.4%[6]；补充布拉氏酵母后提高三联疗法幽门螺旋杆菌根除率提高到80%[7]。目前，布拉氏酵母在动物上也展开了研究，给新生仔猪补饲布拉氏酵母，仔猪腹泻率和腹泻严重程度显著降低，其早期阶段整体健康得到改善[8]。布拉氏酵母能提高肉鸡血清谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性，降低丙二醛含量，具有作为肉鸡抗氧化剂的潜力[9]。在猪、鸡等的单胃动物研究较多，在反刍动物上的研究较少。本试验旨在通过添加不同水平的布拉氏酵母对犊牛腹泻率、血清免疫、抗氧化指标及粪便微生物的影响，为益生菌的推广和犊牛健康无抗养殖提供理论技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

布拉氏酵母菌为石河子大学饲料生物技术实验室收藏菌种，将菌粉稀释成10-8～10-9进行活菌计数，测得有效活菌数1.38×1010CFU/g。试验选择初生重[（38.16±3.73）kg]相近的健康中国荷斯坦犊牛48 头，随机分为4组，每组12头，各组公母对半。布拉氏酵母在各组的添加量分别为0（对照组）、1、3、5 g/（d·头），试验期为42 d。

1.2 饲养管理

试验选用的犊牛出生后与母牛分开，1 h 内灌服4 L 优质初乳。试验犊牛均采用犊牛岛单独饲养，保证充足的活动空间。每天两次饲喂牛乳，分别为早上7 点和下午4 点，7 d 开始补充开食料，21 d 开始补饲苜蓿，整个试验期任其自由采食并保证充足的饮水。开食料及苜蓿的添加根据前一天的采食量添加，保证每次有剩余。布拉氏酵母菌添加至牛乳中，确保其完全食入。定期对犊牛岛进行清扫和消毒处理，严格按照牛场规定进行饲喂。开食料组成及营养水平见表1，牛乳和苜蓿营养水平见表2。

表1 开食料的组成及营养水平（风干基础，%）

表2 鲜奶和苜蓿的营养水平（风干基础，%）

1.3 检测指标及方法

1.3.1 腹泻率的测定

试验开始后每天观察犊牛的排粪情况，参照Lee 等[10]的方法对粪便进行评分，评分标准见表3。当粪便被评为3分及以上时记为腹泻，按照牛场治疗方案进行治疗，每头犊牛每腹泻1 d 记为腹泻1 次。计算腹泻率。

表3 粪便评分标准

腹泻率(%)=Σ(腹泻头数×腹泻天数)/(总头数×试验天数)×100。

1.3.2 血液样本的采集与指标测定

分别于试验的1、21 d 和42 d 晨饲前，用抗凝真空采血管从犊牛颈静脉采血10 ml，将采集的血液静置于阴凉处30 min，以3 000 r/min 离心15 min，分离血清，-20 ℃冷冻保存待测。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白细胞介素-1β(IL-lβ)、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、总抗氧化能力(T-AOC)含量，丙二醛（MDA）使用生化试剂盒测定，ELISA试剂盒与生化试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司，具体操作参考试剂盒说明书进行。

1.3.3 粪便中大肠杆菌及乳酸菌的计数

分别于试验的21 d 和42 d 晨饲前，每组随机选取3头犊牛采集新鲜的犊牛粪便，并分装至无菌的冻存管里，立即冷藏带回实验室进行粪便中大肠杆菌和乳酸菌的计数。在无菌环境下取犊牛粪便1 g，装入盛有9 ml生理盐水的无菌试管里，在漩涡振荡器上振荡至混匀。将其配置成10-1稀释液，用移液枪取该稀释液1 ml 移入装有9 ml 生理盐水的无菌试管里用漩涡振荡器振荡，制备成10-2稀释液，以此类推配置10-4～10-6稀释液，每个稀释度做两个平行，大肠杆菌采用伊红美蓝培养基培养24 h，乳酸菌采用MRS培养基培养36 h[11]。粪便微生物数量以每克粪便中含细菌群落总数的对数[lg（CFU/g）]表示。

1.4 数据统计与分析

试验数据用Excel 2016 初步整理与计算，采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，并采用LSD法进行多重比较，试验结果用“平均值±标准差”表示，以P＜0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 布拉氏酵母对哺乳犊牛粪便评分和腹泻率的影响

表4 布拉氏酵母对哺乳犊牛粪便评分及腹泻率的影响

由表4可知，1～21 d时，3、5 g/（d·头）试验组犊牛的粪便评分显著低于对照组（P＜0.05），且腹泻率1、3、5 g/（d·头）试验组比对照组分别降低了35%、52%和42%（P＜0.05）；22～42 d 时，各组犊牛粪便评分差异不显著（P＞0.05），腹泻率差异不显著（P＞0.05）；1～42 d时，3 g/（d·头）试验组犊牛的粪便评分显著低于对照组（P＜0.05），腹泻率差异不显著（P＞0.05），其他组相较于对照组都有所降低。

2.2 布拉氏酵母对哺乳犊牛血清免疫球蛋白含量的影响

表5 布拉氏酵母对哺乳犊牛血清免疫球蛋白含量的影响(ng/l)

由表5可知，试验第21 d，3、5 g/（d·头）试验组犊牛的血清IgA、IgM 和IgG 含量显著高于其他组（P＜0.05）；试验第42 d，3 g/（d·头）试验组犊牛的血清IgG含量显著高于其他组（P＜0.05），其他含量各组间差异不显著（P＞0.05）。

2.3 布拉氏酵母对哺乳犊牛血清细胞因子的影响

表6 布拉氏酵母对哺乳犊牛血清细胞因子含量的影响(ng/l)

由表6可知，试验第21 d，3、5 g/（d·头）试验组犊牛的血清IL-2 含量比对照组分别提高了11.45%和9.34%（P＜0.05），3、5 g/（d·头）试验组犊牛的血清IL-4含量比对照组提高了18.21%和11.98%（P＜0.05），对照组犊牛的血清IL-1β和TNF-α含量显著高于其他各组（P＜0.05）；试验第42 d，各组间各项指标间差异不显著（P＞0.05）。

2.4 布拉氏酵母对哺乳犊牛血清抗氧化指标的影响

由表7可知，试验第21 d，3、5 g/（d·头）试验组犊牛的血清MDA含量显著低于对照组（P＜0.05），T-AOC差异不显著（P＞0.05）；试验第42 d，3 g/（d·头）组犊牛的血清MDA含量显著低于对照组（P＜0.05），T-AOC含量各组差异不显著（P＞0.05），但较对照组有所提高。

2.5 布拉氏酵母对哺乳犊牛粪便微生物的影响

表7 布拉氏酵母对哺乳犊牛血清抗氧化指标的影响

表8 布拉氏酵母对哺乳犊牛粪便微生物的影响[lg(CFU/g)]

由表8 可知，试验第21 d，与对照组相比各试验组犊牛粪便中大肠杆菌数分别降低了4.55%（P＞0.05）、14.71%（P＜0.05）和13.13%（P＜0.05），与对照组相比各试验组犊牛粪便的乳酸菌数量增加了6.79%（P＞0.05）、16.29%（P＜0.05）、8.60%（P＜0.05）；试验第42 d，各组间大肠杆菌数量差异不显著（P＞0.05），与对照组相比3、5 g/（d·头）试验组犊牛粪便的乳酸菌数量增加了16.77%和15.20%（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 布拉氏酵母对哺乳犊牛粪便评分和腹泻率的影响

前期粪便评分和腹泻率是评估腹泻的严重程度和频率的指标[12]。布拉氏酵母是一种非致病性酵母，用于治疗人类抗生素相关的腹泻[13]，具有显著的临床效果[14]。在动物的应用中，从出生开始就使用含有3.3×109CFU/g 单独剂量的干布拉氏酵母糊状物饲养的仔猪，粪便得分较低，腹泻天数较少[8]。补充酿酒酵母培养物，可以改善犊牛粪便评分[15]，还可以降低犊牛和羔羊发病率、死亡率和治疗病死率[16]。有研究显示补充益生菌与对照组相比，犊牛粪便评分和腹泻持续时间显著降低(P＜0.05)[17]，益生菌组腹泻犊牛数量和腹泻率低于对照组[18-19]。本试验添加布拉氏酵母降低了早期哺乳犊牛的粪便评分和腹泻率，添加3 g/（d·头）的犊牛腹泻率最低，与前人研究结果一致。类似的还有，在代乳粉中添加布拉氏酵母的小牛断奶前腹泻天数减少[12]，犊牛死亡率和发病率较低，有助于犊牛克服生命早期的挑战[20]。然而也有不同报道，Cruywagen等[21]报道饲喂益生菌对健康没有积极的影响。造成这种原因可能由于益生菌的种类、添加量和添加方式的差异。

大肠杆菌是引起犊牛腹泻最常见、最重要的原因之一，添加益生菌组犊牛腹泻率的降低常常伴随着粪便乳酸菌含量的增加[18]，与本试验中另一结果相似，试验组犊牛粪便中大肠杆菌含量低于对照组，乳酸菌含量高于对照组。乳酸菌含量增加引起犊牛肠道pH值的降低,产生酸性环境抑制病原菌的定植[22]。因此，布拉氏酵母减轻幼仔的腹泻，可能由于布拉氏酵母通过平衡肠道菌群减少致病菌，保障肠道健康进而提高机体免疫力。

3.2 布拉氏酵母对哺乳犊牛血清免疫指标的影响

新生犊牛免疫系统未发育完全，因此，幼仔在成长早期可能无法有效地应对外部压力[23]，因此犊牛早期必须从初乳中获得免疫球蛋白来提高免疫力。体液免疫是免疫系统的组成部分，该系统由一系列参与病原体清除的免疫蛋白（IgA、IgG、IgM）组成，主要由释放抗体的B淋巴细胞介导[24]。免疫球蛋白在免疫功能中发挥着重要作用，可作为反映动物体液免疫状态的参数，其含量的增加代表着机体免疫力的增加。有报道嗜酸乳杆菌以剂量增加的方式增加IgA 生成细胞的数量[25]，添加了酵母培养物的蛋鸡具有较高的血清IgA 和IgG 浓度，且IgM 有升高的趋势[26]，对绒山羊能显著增加血清IgA 含量,并提高血清IgG 含量[27]，表明饲粮添加益生菌可提高机体免疫功能。本试验前期添加布拉氏酵母能够提高犊牛血清中IgA、IgG 和IgM的浓度，试验后期3 g/（d·头）的IgG浓度显著高于对照组，其他组有增加的趋势。与其一致的还有，布拉氏酵母显著提高肉鸡空肠IgA 阳性细胞数量显著增加[28]，增加猪肠道内IgA抗体分泌[29]。因此，布拉氏酵母可能通过促进B淋巴细胞增殖、激活B淋巴细胞产生大量免疫球蛋白，从而提高动物的免疫功能。

测定细胞因子的产生是评估细胞介导免疫反应的一个重要组成部分[30]。细胞因子通常可以分为两种类型：促炎(IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α)和抗炎细胞因子(IL-4、IL-10和TGF-β)。这些免疫细胞从宿主体内清除病原体，而它们的表达与免疫系统的病理状态有关，并可能消除对宿主健康和生长的严重影响[31],促炎细胞因子对于先天和适应性免疫反应的发展和功能都是必要的，抗炎细胞因子参与炎症反应、免疫耐受、抗体合成和疾病易感性的降低[32]。有研究发现，如枯草芽孢杆菌PB6可以降低血清IL-6的水平和TNF-α,从而减轻结肠黏膜炎症[33]，给绵羊灌注酵母培养物能够显著提高血清中IL-2和IFN-γ含量[34]，布拉氏酵母可以降低仔猪IL-1β和IL-6含量[35-36]。本试验添加布拉氏酵母能显著提高犊牛血清的IL-2和IL-4的含量，显著降低IL-1β和TNF-α的含量。表明添加适量布拉氏酵母能够防止炎症的发生，降低促炎症因子的释放。此外，发现给巨噬细胞[37-38]中补充益生菌可促进细胞因子的产生，可见，调节促炎、抗炎细胞因子和其他免疫介质的表达或者通过促进T 细胞增殖和细胞因子分泌可能是影响布拉氏酵母免疫调节作用的重要机制。

3.3 布拉氏酵母对哺乳犊牛血清抗氧化指标的影响

许多研究表明，饲粮中添加益生菌可以消除动物体内的自由基，增强机体的抗氧化功能[39-40]。T-AOC是体内抗氧化能力的综合衡量方法[41]，丙二醛是脂质过氧化或脂质分解的标志[42]。有研究表明氧化应激越严重，血浆中丙二醛浓度越高[43]。给羔羊日粮中添加富硒酵母和枯草芽孢杆菌均能降低丙二醛的含量[44]，添加粪肠杆菌也可以提高肉鸡肌肉的T-AOC 水平，提高机体的抗氧化能力[45]。本试验结果与上述结果一致，日粮中添加布拉氏酵母能降低犊牛的丙二醛含量，提高T-AOC含量，这表明布拉氏酵母能够提高犊牛的抗氧化能力。小肠是氧化损伤最早的器官，其完整性对抵抗氧化损伤具有重要意义，添加乳杆菌[46]和布拉氏酵母[9]可以通过释放谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）作为抗氧化剂来防止病原菌对小肠的氧化损伤，我们推测，犊牛血清中抗氧化活性的增加可能是补充布拉氏酵母改善胃肠道的健康有关。

3.4 布拉氏酵母对哺乳犊牛粪便微生物的影响

益生菌能产生抑制其他微生物生长的抗菌剂和代谢化合物[47]，这些代谢物如乳酸的产生降低了pH值，而较低的pH 值在抑制致病菌的发育中起重要作用[48]。布拉氏酵母可以使病原菌脂多糖去磷酸化，抑制致病菌在肠道的活性[49]，肠道大肠菌群的减少有助于减轻动物的胃肠道问题。补充不同类型的微生态制剂后粪便中大肠杆菌的数量较对照组明显减少(P＜0.05)[50]，日粮中添加布拉氏酵母能降低断奶仔猪粪便中的大肠杆菌数量[51]。本试验结果中添加布拉氏酵母的犊牛粪便中大肠杆菌数量低于对照组，3、5 g/（d·头）处理组最为显著,与上述研究结果相似，表明添加布拉氏酵母能够一定程度的抑制致病菌。

用嗜酸乳杆菌处理的犊牛的粪便乳酸杆菌计数显著高于空白对照组[52]，补充酿酒酵母可以增加粪便中的乳酸杆菌数量[53]。另外发现，对奶牛直接饲喂布拉氏酵母能够增加纤维杆菌和罗斯氏菌、欧陆森氏菌属潜在益生菌[54]。同样的本试验发现添加3、5 g/（d·头）布拉氏酵母的犊牛粪便中乳酸菌数量显著高于对照组，与上述研究结果相似。可能，布拉氏酵母与犊牛肠道内的乳酸杆菌协同作用，产生乳酸和其他对乳酸杆菌生长有关的代谢物，与犊牛肠道内的大肠杆菌产生拮抗作用，抑制大肠杆菌的定植。因此，布拉氏酵母在调节犊牛肠道菌群平衡方面有一定的积极作用。