实时定量PCR与传统微生物培养法诊断呼吸机相关性肺炎病原体的性能比较

王海晶 王小军

呼吸机相关性肺炎(Ventilator associated pneumonia，VAP)是指机械通气48 h后至拔管后48 h内出现的肺炎，是重症患者最常见的的院内感染。约10%～20%接受48 h以上的机械通气的患者可能患VAP[1]。其实际死亡率仍存在争议，如果初始治疗不合适，其死亡率可超过50%[2]。由于VAP的实质是多种病原体感染，故一般采用抗生素治疗，且通常使用广谱抗生素。若能够知道污染的微生物的明确种属，则可以降低广谱抗生素的使用，以避免细菌产生耐药性，以及减小药物毒性[3-5]。一种基于分子的即时定量方法(实时定量PCR方法)可在几个小时内获得细菌鉴定和定量信息，因此能够为临床治疗快速提供准确的信息，在患病早期可进行有效的和有针对性的抗生素治疗。本研究在我院收治的疑似呼吸机相关性肺炎患者中，采用气管内抽吸(Endotracheal Aspirate ，ETA)以及支气管肺泡灌洗(Bronchoalveolar Lavage ，BAL)两种方式采集患者样本[6]，使用常规微生物培养和实时定量PCR进行微生物分析，比较常规培养方法与实时定量PCR方法诊断VAP病原体的性能。

资料与方法

一、研究对象及样本采集

选择2016年2月～2018年5月在我院诊治的患者。所有患者需插管并接受机械通气治疗至少48 h以上，且需符合以下所有标准：(1)年龄超过18岁，(2)影像学检查可见新的浸润性病变，体温>38.3℃或<35.0℃，白细胞计数>10 000/uL或<4500/uL和新发现的化脓性气管分泌物。患有以下情况的病人需要被排除(1)患有严重的低氧血症(PaO2/FiO2<100)，(2)免疫功能低下或中性粒细胞减少，(3)有难治性脓毒性休克[1]。

在符合本研究资格的112名患者中，78%的患者为男性，年龄中位数为62岁。其中74%的患者临床肺部感染得分为6， 33.9%(38/112)的VAP病人在BAL和ETA收集的当天接受β-内酰胺类以及第三代头孢菌素抗生素治疗。抗生素治疗的患者和未进行抗生素治疗的患者没有观察到显著的差异。

二、样本采集

对于诊断为VAP的患者，在诊断当天通过护士在无菌条件下将导管插入患者气管30厘米处通过导管抽吸收集ETA样本，之后收集BAL样本[7]。BAL样本收集采用支气管镜通过气管导管穿过延长管引入到呼吸管中。在37℃条件下，使用20mL 生理盐水分为五等份对叶片进行灌洗，丢弃第一个灌洗样品，不用于微生物学分析。BAL和ETA，分别取两种样品的一部分用于常规微生物分析，并将相同体积的剩余部分置于-80℃超低温冰箱内冷冻，用于实时定量PCR分析。

三、方法

1 常规培养方法 采用《欧洲临床微生物学手册》推荐的方法进行 BAL和ETA样本的常规微生物学分析[8]。 ETA样本振荡混匀后，吸取100微升加入1mL无菌盐水溶液进行稀释，吸取10uL该悬浮液接种于非选择性(胱氨酸乳糖电解质缺乏，COS)和选择性(巧克力琼脂)琼脂平板在37℃下培养48 h。稀释的目的是获得103CFU/mL的检测阈值。取10mL BAL原液直接接种在检测阈值为102CFU/mL的相同琼脂平板上。使用Vitek2系统，VitekMS系统或API试剂盒进行细菌鉴定。BAL样本中至少有一种病原体含量为104CFU/mL，而ETA为106CFU/mL，则该数据结果具有意义。

2 实时定量PCR方法 细菌DNA分批次进行提取。所有样本中添加确定含量的葡萄球菌(BAL为1500 CFU，ETA为7500 CFU)，用于样本处理对照(Specimen Processing Control，SPC)。使用NucliSENS easyMag DNA试剂盒提取DNA ，洗脱体积为55 uL[9]。引物和探针用于检测SPC和VAP中涉及的主要病原体。如金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，嗜血杆菌流感嗜血杆菌，奇异变形杆菌，大肠杆菌，粘质沙雷氏菌，肺炎链球菌，鲍曼不动杆菌，产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产气克雷伯氏菌。采用标准菌株制备每种病原体的定量标准曲线。如常规培养方法一样，BAL样本中至少有一种病原体含量为104CFU/mL，而ETA为106CFU/mL，数据结果才有意义。该方法对于每种病原体的检测限为102CFU/mL，最低定量限为103CFU/mL，定量上限为107CFU/mL。

四、统计方法

本研究旨在评估实时定量PCR法(qPCR)和常规培养方法在检测VAP 患者ETA和BAL样本细菌含量之间的差异。主要研究了三种主要盛行的病原体(金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌)，以常规培养法的微生物学结果作为参考标准。通过受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic，ROC)来表示实时定量PCR法在检测三种主要盛行的病原体的效果。常规微生物学方与实时定量PCR方法结果的决策阈值BAL为104CFU/mL，ETA为106CFU/mL，且在此阈值范围上进行BAL和ETA样品之间的一致性评估。

结 果

一、样本的采集

共收集了所有112个疑似VAP患者的BAL样本，收集了101份ETA 样本，由于部分样本体积太小，而不能分析，故排除在外。在处理112例BAL样本时，有一例没有成功。因此提供了剩余111个BAL样本的结果。在BAL样本中，分别有77.6%和67.6%疑似VAP患者通过常规培养方法和qPCR证实。在ETA样本中，分别有61.4%和63.4%疑似VAP患者通过常规培养和qPCR证实。在BAL和ETA样本中，分别有45.9%和21.8%含有两种或更多种微生物。主要分离的微生物是金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌。

二、疑似VAP患者BAL样本中qPCR与常规培养结果的一致性

qPCR检测BAL样本中金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌的性能如(图1A)所示以及相关的ROC曲线如(图1B)所示。曲线下面积>0.86。在决策阈值(104CFU/mL)下测定金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌 qPCR的敏感度，分别为95.8%，100%和75.2%(表1)。其他不太普遍的病原体，如：敏感性大肠杆菌，产气肠杆菌和奇异变形杆菌的比例>92%，肺炎链球菌达到85.3%。

图1 qPCR与常规方法在疑似VAP患者BAL样本微生物学分析的一致性及相关ROC曲线图

(a)qPCR方法与常规培养法对于BAL 样本中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌的结果一致性，两种方法菌含量均取对数值，蓝色代表一致的结果，红色代表不一致的结果。(b)金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌工作特征曲线图。

表1 qPCR与常规方法在疑似VAP患者BAL样本微生物学分析的一致性

三、疑似VAP的患者ETA样本中qPCR与常规培养结果一致性

qPCR检测ETA样本中金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌的性能如(图2a)所示以及相关的ROC曲线如(图2b)所示。曲线下面积>0.91。铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌qPCR灵敏度为100%，但金黄色葡萄球菌较低80.2%(表2)。大多数细菌的qPCR特异性很高，范围从89.5%到100%(表2)。

四、疑似VAP患者BAL与ETA的样本微生物结果的一致性

BAL和ETA样本的结果一致性计算主要参考三个目标(金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌)以及两种测试方法(常规方法和qPCR)。对于常规培养和qPCR，样本所有目标微生物之间的一致性分别为55.8%和57.3%。对于金黄色葡萄球菌，常规方法一致性要好于qPCR ，分别为78.1%和68.7%。相反，对于铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌，qPCR比传统培养方法相比，一致性更好，铜绿假单胞菌分别是88.7%和67.6%，流感嗜血杆菌分别为82.1%和63.9%。

图2 qPCR与常规方法在疑似VAP患者ETA样本微生物学分析的一致性及相关ROC曲线图

(a)qPCR方法与常规培养法对于ETA样本中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌的结果一致性，两种方法菌含量均取对数值，蓝色代表一致的结果，红色代表不一致的结果。(b)金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌工作特征曲线图。

表2 qPCR与常规方法在疑似VAP患者ETA样本微生物学分析的一致性

讨 论

本研究人群主要是临床疑似VAP的患者，其中有74%的患者临床肺部感染得分>6，因此用于比较实时定量PCR法与常规微生物方法是比较可靠的。研究微生物快速诊断技术的意义在于可以为临床诊断提供更加快速有效的微生物信息，以便有针对性的进行治疗，降低由于使用广谱抗生素而导致的治疗风险[10-12]。

实时定量PCR方法可以直接测定细菌DNA来确定细菌种类，实验过程中在每个样本中均加入对照，使用了半自动化的提取流程，避免了高度手动提取过程带来的变异[13-14]，因此，与常规方法的结果较一致。本实验中BAL和ETA样本中分别获得了38和41个假阳性结果， DNA扩增是qPCR的关键步骤，但是不能区分有活力和无活力的细菌，因此而导致的假阳性结果，是目前所有可用的qPCR方法的主要限制因素之一。因此，表明了定量PCR的重要性，可以减少假阳性的数量。尽管有假阳性，早期针对性的抗生素治疗的益处高于抗生素过度使用的风险。在本研究中BAL样本阴性预测值在95.2%和100%之间变化，ETA样本在 93.7%和100%之间。以上结果表明了分子生物学技术的准确性，以确认没有目标菌。

实时定量PCR方法会受到阈值的影响，在研究中，标准品和检测样本采用相同的阈值设置(BAL为104CFU/mL，ETA为106CFU/mL)，如果适当调整阈值则结果有所改变。例如，对于ETA，阈值设置为105CFU/mL 代替106CFU/mL，可以显著增加肠杆菌qPCR的灵敏度，从59.3%提高到91.7%。然而，阈值调整会降低特异性[15]。

本研究的结果表明可以使用分子生物学方法快速检测疑似VAP的样本，量化细菌DNA以便更好地评估细菌的致病性。本研究的目的是比较实时定量PCR方法和常规方法，是否适用于同一个病人两种样本(BAL和ETA)，即便只获得了少量ETA样本，依然可以使用分子方法。实时定量PCR法可以从两种类型的标本中识别和量化相同的病原体。

实时定量PCR方法也具有一定的局限性。首先，针对BAL样本制备方案效率不高；第二，实时定量PCR仅限于检测参与VAP的主要细菌；第三，本研究采用分子定量的方法应用到VAP的微生物学诊断，未将体外研究的数据和结果在体内领域进行验证；第四，用于分子分析的样品是冻存品，可能影响灵敏度和特异性；最后，微生物实验室使用分子方法来作为日常检验方法，受到以下几个因素的限制，如手动步骤的数量，各提取批次微生物参考菌株的处理，用于量化的标准曲线等。

总之，本研究表明实时定量PCR方法诊断VAP患者病原体与常规微生物学方法的结果具有一致性，针对VAP中常见的病原体，实时定量PCR具有高度特异性和良好的敏感性，因此能够提供可靠的定量微生物学数据。