玉米根际高效溶磷菌的筛选、鉴定及促生效应研究

2020-06-09万水霞王静李帆蒋光月徐文静刘祚军

生物技术通报 2020年5期

万水霞王静李帆蒋光月徐文静刘祚军

（1. 安徽省农业科学院土壤肥料研究所安徽养分循环与资源环境省级实验室，合肥 230031；2. 安徽省农业科学院农业工程研究所，合肥 230031）

玉米生产在我国粮食生产中占有非常重要的地位。玉米种植生产中主要依赖化学肥料，但是随着化肥的不合理施用，玉米品质下降、环境污染、土壤板结等一系列问题日益突出，严重影响我国农业的可持续发展［1-2］。随着农业部化肥零增长减量化行动的实施，减少化肥用量、扩大新型肥料使用成为势趋。生产实践证明，利用优良促生菌研制的微生物肥料不仅具有肥效作用，还可以减少生产和使用农药、化肥带来的环境和食品污染及非再生能源消耗［3-4］。因此，应用微生物肥料来替代部分化肥逐渐成为现代农业技术的研究热点。

植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是微生物肥料重要的种质资源，生存于植物根际或根表，可直接或间接地促进植物生长发育。部分PGPR 可以通过固氮、溶磷、解钾、分泌植物激素如吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）等促进植物的生长发育，还可增强植物对病害、重金属、盐碱等逆境的抗性［5-6］。PGPR 在进行生命活动和新陈代谢的过程中，可通过降解土壤中的有机物和难溶性矿物来增加土壤的养分含量。如解磷细菌可分泌有机酸与部分金属离子鳌合，将土壤中难溶性磷转化为可溶性磷，供植物吸收，促进植物生长［7］；同时植物生长素IAA 被当作筛选PGPR 的重要指标，根际促生菌通过分泌IAA 来促进植物合成生长调节物质，从而促进植物生长发育［8］。本研究从大田玉米根际分离筛选兼有溶磷及分泌生长激素的优良PGPR 菌株，并利用形态学和分子生物学对其进行分类鉴定，以期为研制复合微生物肥料提供新的种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

土壤样品分别采自安徽省合肥、肥东、巢湖、桐城的玉米植株根际土壤。用抖落法获得植物根际土壤，放入无菌封口袋中混匀、封口、编号，装入冰盒内带回实验室分离。

培养基：LB 培养基用于分离和保存根际细菌，PKO 培养基用于溶磷菌株的分离与纯化［9-11］。 PKO 培养基：葡萄糖10.0 g、酵母粉0.5 g、（NH4）2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、Ca3（PO4）25.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、补加蒸馏水至1 L，调节pH 为 7.0，琼脂15 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株筛选称取根系土壤配制不同浓度梯度的土壤悬液，分别吸取0.1 mL 悬液涂布培养基平板，每个处理3 次重复，28℃恒温培养5 d。挑取优势菌株，进行纯化和多次传代。

1.2.2 根际溶磷细菌溶磷能力测定将筛选出来的细菌接种于PKO 平板上，30℃ 培养4-6 d，观察有无溶磷圈产生，测量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d），计算溶磷圈与菌落直径比（D/d）。比值越大，表示溶磷能力越强。将溶磷圈大的细菌进行液体培养，并设置空白对照，各处理3 次重复，30℃，180 r/min 下振荡培养5 d，将发酵液离心 10 min（4℃，10 000 r/min），采用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷的含量，并测定培养液pH 值［12］。

1.2.3 溶磷菌株分泌IAA 特性测定定性测定：参考Glickman 等［13］的方法，将分离纯化的菌株分别接种于LB 液体培养基中（添加L-色氨酸，使终浓度为0.5 g/L），37℃、180 r/min 震荡培养2 d，离心后取50 μL 上清液加入等体积Sackowcki’s 显色剂在白瓷板上避光显色30 min 后观察，若出现粉红色则为阳性，说明该菌株能够分泌IAA。

定量测定：取阳性菌株的上清液与Sackowcki’s 显色剂避光显色30 min 后的混合液，测定在530 nm 的吸光值，以空白培养基作为对照，以纯IAA 的吸光值制作标准曲线，计算出各反应中的阳性菌株产IAA 的量（μg/mL）［14］。

1.2.4 菌株鉴定观察菌落形态特征及革兰氏染色特性，生理生化试验参照《常见细菌系统鉴定手册》进行测定，对照《伯杰细菌鉴定手册》及相关文献鉴定菌株［14-15］。

分别提取菌株的总基因DNA，采用16S rDNA 通用引物27f（5′-AGAGTTT-G-ATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行16S rDNA 的PCR 扩增，将PCR 产物送生物工程（上海）有限公司进行测序。测序结果提交至GenBank，并进行Blast 序列比对分析，使用MEGA 7 软件通过邻接（Neighbour-joining）法构建系统进化树。

1.2.5 盆栽实验研究溶磷菌株的促生效应盆栽实验于2019 年5-6 月进行，供试土壤来自安徽怀远农田，供试作物为苋菜。试验共设6 个处理，重复5 次，分别为：处理1，不接种任何菌剂（CK）；处理2，接种CH07（CH07）；处理3，接种FD11（FD11）；处理4，接种FD13（FD13）；处理5，接种CH07 与FD11 的混合菌剂（复合1）；处理6，接种CH07、FD11、FD13 的混合菌剂（复合2）。

供试菌株分别活化后置于LB 培养基振荡培养24 h，用无菌水调节菌悬液浓度为1×108CFU/mL（OD600约0.5），采用灌根方式进行接种，接种量10 mL/株。自然条件下室内培养，每隔5 d 重复处理1 次，整个试验期间保持土壤湿润，30 d 后收获植株测定株高及鲜重。

1.2.6 数据处理采用Excel 2010 和SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，使用最小显著差异法（LSD）检验进行多重比较（P＜0.05）。

2 结果

2.1 溶磷菌株筛选及其溶磷能力

从安徽不同地区玉米根际土壤中共分离纯化57 株细菌，其中13 株细菌具有溶磷功能，能在PKO无机磷培养基上产生清晰的溶磷圈。其中，5 株来自安徽肥东（菌株标号为FD），5 株来自巢湖（菌株标号为CH）及3 株来自安徽桐城（菌株标号为TC）。根据溶磷圈与菌落直径比值的大小可以定性判定溶磷特性的大小。结果（表1）显示，菌株FD11、CH07 具有较强的溶磷能力，其 D/d 比值分别为2.05、1.86。

将能产生溶磷圈的13 株菌株分别接种于液体培养基中振荡培养5 d，测定各菌株对磷酸三钙的溶解能力，结果显示，这3 个样地中分离的根际促生菌的溶磷能力差异显著，溶磷量在88.2-368.5 mg/L 之间。其中，发酵液的有效磷含量最高的是CH 07菌株，达368.5 mg/L；其次是FD11 菌株321.5 mg/L、CH09菌株318.9 mg/L。各菌株培养液pH 在4.22-5.69 之间，同时，菌株发酵液pH 值越低，速效磷含量越高，即各菌株解磷能力与发酵液pH 值呈现出一定负相关，相关性达到显著水平。

2.2 溶磷菌株分泌IAA 能力分析

利用显色法和比色法分别对此次筛选中具有溶磷能力的菌株进行分泌生长素（IAA）能力测定，结果（表2）显示，6 株菌株具有分泌IAA 的能力。各菌株的显色反应与分泌IAA 的量成正比关系，即分泌量越大，颜色反应越强烈。各菌株IAA 分泌量在14.71-30.95 mg/L。其中，FD03、CH07 菌株分泌IAA 活性显著高于其他菌株，IAA 产量分别为30.95 mg/L、30.93 mg/L，且菌株FD03、CH07 相互之间差异不显著。菌株FD11、TC11、CH13、FD07 也具有较强分泌IAA 活性，IAA 产量分别为15.93 mg/L、15.31 mg/L、14.74 mg/L、14.71 mg/L。综合菌株的溶磷促生特性分析，FD03 菌株虽然分泌IAA 量最高但溶磷活性较弱，故选择溶磷促生特性均较强的CH07、FD11 菌株作为目标功能菌进行下一步研究。

表1 13 株溶磷菌溶磷能力及培养液的pH 值

表2 产IAA 能力的测定结果

2.3 溶磷菌株鉴定

2.3.1 溶磷菌株菌落形态、生理生化特征经平板划线、革兰氏染色，观察菌株培养特征及形态特征（图1），CH07在LB平板上培养24 h后呈圆形不透明，表面光滑，产芽孢，G+，细胞直杆状。FD11 在LB平板上培养24 h 后菌落小而致密，干而不透明，幼时表面光滑，边缘整齐，继而生长成绒毛状，表面起粉，G+，细胞直杆状。CH07 及FD11 分离物的主要生理生化特征见表3。

图1 菌株CH07（A）及FD11（B）的菌落形态和镜下Gram 染色图

2.3.2 溶磷菌株16S rDNA 分子学鉴定将测序得到菌株的16S rDNA 序列提交NCBI 数据库进行BLAST 序列比对，并将序列提交GenBank，获得CH07 和FD11 登录号分别为MK474942.1 和MH021963.1。使用MEGA7 软件，通过邻接法构建进化树。结果表明，菌株CH07 与Bacillus aryabhattai的序列具有最高同源性（图2-A），菌株FD11 与Streptomyces maritimus的序列具有最高同源性（图2-B）。

表3 生理生化实验结果

图2 基于菌株CH07（A）和FD11（B）16S rDNA 的neighbor-joining 系统发育树

2.4 盆栽试验结果

苋菜种植30 d 后，测定不同处理组苋菜的生长参数，结果见表4。接种不同菌株均不同程度地促进了苋菜的生长，其中，复合菌剂1 对苋菜的促生效果最优。从增加苋菜的株高、茎粗、叶片数、地上部鲜重方面来看，复合菌剂1 分别比对照增加14.2%、11.2%、27.7%、59.2%；菌株CH07 促生效果次之，分别比对照增加12.7%、10.9%、20.3%、46.5%；复合菌剂2 的促生效果最低，分别比对照增加2.24%、0.66%、1.13%、1.34%。复合菌剂1 及菌株CH07 与CK 相比，除茎粗差异不显著其他差异均达显著水平（P＜0.05）。复合菌剂2 与CK 差异不显著。

表4 不同PGPR 菌株处理苋菜生长性状

3 讨论

植物根际促生菌因具有多种有益生物学作用，成为国内外研究热点。土壤中无机磷约占总磷60%-80%，磷酸盐中又以钙盐为主，因此细菌解磷酸三钙的能力可在一定程度上反映出细菌在土壤中解磷能力的强弱，筛选解磷酸三钙能力较强的细菌用于菌肥生产更适合推广应用［10，15］。另外，很多研究者研究发现溶磷圈的大小和溶磷量不完全呈正相关，溶磷圈的大小并不能完全反映溶磷能力的高低［16-17］。因此，本研究以溶磷圈法作为定性测定，钼锑抗比色法定量测定，两者相结合，来确定菌株的溶磷能力，降低误差。结果表明，菌株CH07 溶磷量最高为368.5 mg/L，其次是菌株FD11，溶磷量321.5 mg/L。关于溶磷量与培养液pH 之间的关系，之前的研究有不同的结论。部分研究显示，细菌因产酸而具备溶磷能力［18-19］。本研究结果与之一致，本研究结果表明溶磷量与溶液pH 呈显著负相关，说明溶磷与细菌产酸密切相关。也有学者研究认为溶磷量与pH之间没有相关性［20］，究其原因，主要是由于溶磷菌的溶磷机理多元化所致。对于不同菌株发酵液中产生有机酸种类、浓度及酸的产生原因有待进一步研究。

IAA（1-氨基环丙烷-1-羧酸）是一种植物生长激素，在一定浓度下能提高农作物产量，菌株CH07、FD11 具有产IAA 能力。刘泽平等［21］筛选出的根际促生菌Bacillus ginsengisoliLZP07 IAA 分泌量53.31 mg/L，邓振山筛选的菌株中有8 株具有分泌IAA 能力，其中菌株XYN-2 能稳定分泌IAA 36.61 mg/L［22］。前人的报道显示高IAA 活性的菌株大多为芽孢杆菌属，CH07 菌株经分子和生理生化试验鉴定为阿耶波多氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）IAA 分泌量为30.93 mg/L；FD11 菌株鉴定为链霉菌（Streptomyces maritimus）IAA 分泌量为15.93 mg/L。接种苋菜均表现出显著的促生作用，目前对这2 株菌的抗逆性研究正在进行中。

盆栽试验结果证实从玉米根际土壤中筛选出的PGPR，尤其是CH07 及CH07 与FD11 复合菌剂对苋菜生长有积极作用。CH07、FD11 混合接种优于CH07、FD11 或FD13 的单菌接种的促生效应。促生菌株以一定比例混合培养，发挥了各菌株的协同促生效应，此结果与很多的研究相一致［10，21-22］，但多菌混合，不同菌株之间也会出现相互拮抗的情况。本研究中混合菌剂2 就是由3 种菌混合培养，但该混合菌剂的促生效果相比单一菌株要弱很多，这其中原因可能是3 种菌株混合培养时产生了相互抑制的物质。当然，促生菌促进作物生长的机理是比较复杂的，除了与溶磷或分泌IAA 有关，同时也与促生菌的固氮、分泌其他生长素以及菌株之间的合理比例等因素有关［23］，本试验中出现的情况还需进一步探究。