葫芦素E通过抑制MAPKs/NF-κB通路减轻哮喘小鼠气道炎症*

姜京植， 徐 畅， 王重阳， 李良昌， 李 莉， 李俊峰， 延光海

（延边大学医学院解剖学教研室，吉林省过敏性疾病重点实验室，吉林延吉133002）

哮喘是呼吸系统一种常见的疾病，是世界医学界公认为的4大顽症之一，其主要特征是嗜酸性粒细胞浸润、气道炎症、黏液生成增加和气道高反应性［1］。哮喘与相关1型辅助性T细胞（Th1）/Th2丰度失衡有着密切的关系［2］。哮喘上调Th2细胞产生的白细胞介素（interlukin，IL）-4、IL-5和 IL-13［3］。Th1细胞因子，包括干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）和IL-12参与调节细胞免疫应答。这些细胞因子通过对抗Th2介导的免疫反应来减少IgE合成，从而抑制哮喘的发展［4］。当Th1/Th2丰度动态平衡被破坏时，疾病就会发生。研究显示，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）和核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路的激活在哮喘发病过程中发挥作用［5］。因此，MAPKs和NF-κB信号通路可作为哮喘重要的治疗分子靶点。可以通过抑制MAPKs和NF-κB信号通路的方法来治疗哮喘。

葫芦素E（cucurbitin E，CuE）是从葫芦中分离得到的一种中药化学成分。近年来有研究表明，葫芦素E具有抗炎、抗肿瘤和抗氧化等多种药理作用［6］。这些发现促使我们推测，葫芦素E可能是一种很好的预防和治疗过敏性哮喘的候选药物。为了解决这一问题，我们研究葫芦素E对哮喘小鼠气道炎症反应的作用及机制。

材料和方法

1 材料

1.1 动物及分组 清洁级BALB/c小鼠（7周龄）40只，雌性，购于延吉市健康科学中心，饲养于延边大学实验动物中心清洁级动物房。动物随机分为正常对照（control）组、模型（model）组、葫芦素E低剂量（low-dose CuE）组、葫芦素E高剂量（high-dose CuE）组和地塞米松（dexamethasone，Dexa）组，每组8只。实验前，小鼠在标准实验室条件下用水和标准食品饲养1周。所有动物实验均按照延边大学医学院动物保护与利用机构委员会（延吉市）批准的指导方针进行。

1.2 药品试剂与仪器 葫芦素E购于Sigma；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）购于Sigma；氢氧化铝购于Pierce；抗磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）抗体（sc135642）、抗磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2）抗体（sc7976）、抗磷酸化 p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK）抗体（sc101759）、抗p65抗体（ab16502）、抗磷酸化p65（phosphorylated p65，pp65）抗体（ab53489）和 β-actin抗体（ab8226）购于Santa Cruz及Abcam；IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ酶联免疫检测试剂盒购于上海帝肯公司；BCA蛋白试剂盒购于Rainbio。超声波雾化器为OMRON产品；化学发光成像系统为Bio-Rad产品。

2 方法

2.1 模型制备 模型组、葫芦素E低剂量组、葫芦素E高剂量组和地塞米松组小鼠第1、7和14天腹腔注射致敏液200μL（致敏液的组成为10μg卵清蛋白，1 mg氢氧化铝佐剂和生理盐水）。对照组用等量生理盐水代替。从第21～23天，致敏小鼠暴露于1%OVA的气溶胶中20 min。支气管激发实验在排气塑料室（18 cm×14 cm×8 cm）进行。气溶胶粒子直径约3～5μm。对照组暴露于雾化吸入的PBS中。治疗组从第17天起，每只小鼠灌胃CuE（100或200 mg/kg），每日1次，连续7 d。地塞米松组在暴露于1%OVA气溶胶刺激前1 h腹腔注射地塞米松，自第21天起，每天注射1次。最后一次注射后，小鼠24 h内被处死。

2.2 支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）炎症细胞计数 左侧肺以生理盐水（37℃）灌洗，收集BALF，2 500 r/min离心10 min。回收细胞进行瑞氏染色，光镜下分类计数炎症细胞数量。

2.3 肺组织病理学分析 小鼠肺组织用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋。对肺切片进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）和高碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色。光镜检查。HE染色观察反映支气管炎症的肺组织形态学改变。PAS染色评价杯状细胞增生。测定气道上皮中PAS染色阳性细胞的百分比，以估计粘液的产生量。在200倍放大显微镜视野下，随机选取各切片，进行光强度分析。

2.4 酶联免疫吸附实验 按照制造商的说明书，采用特异性ELISA试剂盒检测BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ。然后，用微板阅读器在450 nm处测量吸光度。

2.5 Western blot分析 小鼠肺组织在样品缓冲液中溶解后变性。由BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。由SDS-PAGE分离等量的蛋白质样品。分离后蛋白质被转移到NC膜上。再用5%脱脂奶粉溶液封闭，并在4℃下与抗体共同孵育过夜。冲洗后，将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗在室温下孵育2 h，用ECL检测试剂检测蛋白条带。

2.6 免疫组化 石蜡切片进行免疫组化分析。即经脱蜡固定后，加入抗NF-κB p65抗体和Ⅱ抗孵育，之后染色封片，应用Image-Pro Plus 6.0对结果进行分析，数据以各组积分吸光度均值与对照组的比值表示。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0分析数据，计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示，选用单因素方差分析（one-way ANOVA）统计方法，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 葫芦素E对小鼠BALF中炎症细胞数量的影响

与对照组比，模型组BALF中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量显著升高；经葫芦素E或地塞米松处理后，这些细胞的数量显著减少（P＜0.05），见图1。此结果表明葫芦素E可减少OVA诱导哮喘小鼠BALF中相关炎症细胞的数量。

Figure 1.The effect of CuEon the numbers of inflammatory cells in BALFof the mice.Mean±SD.n=7.*P＜0.05 vs model group.图1 葫芦素E对小鼠BALF中炎症细胞数量的影响

2 葫芦素E对小鼠BALF中炎症细胞因子含量的影响

与正常组比，模型组BALF中炎性细胞因子IL-4、IL-5及IL-13含量明显增高（P＜0.05），而IFN-γ含量明显降低（P＜0.05）；与模型组比，葫芦素E高剂量组和地塞米松组IL-4、IL-5及IL-13细胞因子含量明显降低（P＜0.05）；与模型组比，葫芦素E低剂量组IL-4及IL-13细胞因子含量明显降低（P＜0.05），而IL-5含量无明显变化（P＞0.05）；与模型组比高、低剂量葫芦素E组或地塞米松组IFN-γ含量明显增高。结果见图2。

3 葫芦素E对小鼠肺组织病理学表现的影响

用HE染色法测定肺切片中炎症细胞数，正常组未见异常；模型组与正常组比，气道周围有大量浸润性炎症细胞（P＜0.05）；葫芦素E高剂量组和地塞米松组炎症细胞浸润明显少于模型组（P＜0.05）。用PAS染色测定杯状细胞的产生，正常组的上皮杯状细胞产生和黏液分泌正常。模型组PAS阳性细胞百分率明显高于正常组（P＜0.05），而葫芦素E组和地塞米松组则气道上皮杯状细胞产生和黏液分泌明显降低（P＜0.05）。结果见图3。

4 葫芦素E对小鼠肺组织MAPKs信号通路活性的影响

与正常组比，模型组肺部p-JNK、p-ERK1/2及pp38 MAPK的含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比葫芦素E高剂量组或地塞米松组，肺部上述指标含量明显降低（P＜0.05），但葫芦素E处理组上述指标含量仍高于正常组（P＜0.05）。结果见图4。

Figure 2.The effect of CuE on inflammatory cytokines content in BALF of mice.ELISA was used to detect the levels of IL-4，IL-5，IL-13 and IFN-γ in BALF.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs model group.图2 葫芦素E对小鼠BALF中炎症细胞因子含量的影响

Figure 3.The effect of CuEon lung histomorphological lesions in the mice（×100）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs model group.图3 葫芦素E对小鼠肺组织病理表现的影响

Figure 4.The effect of CuEon MAPKs signaling pathway activity in lung tissues of mice.Theprotein levelsof p-JNK，p-ERK1/2 and pp38 MAPK were determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs model group.图4 葫芦素E对小鼠肺组织MAPKs信号通路活性的影响

5 葫芦素E对小鼠肺组织NF-κB信号通路活性的影响

用Western blot方法检测p-p65蛋白的水平，结果显示，与正常组相比，模型组肺部p-p65含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比，葫芦素E高剂量组，肺部p-p65含量明显降低（P＜0.05），见图5A。用免疫组化的方法检测p-p65蛋白的表达，结果显示，模型组较正常组肺部p-p65含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比，葫芦素E组肺部p-p65含量降低（P＜0.05），见图5B。

讨 论

在本研究中，我们利用OVA诱导的小鼠哮喘模型来探索葫芦素E对过敏性气道炎症的影响。以地塞米松为标准参考药物，比较葫芦素E抗哮喘活性。首先观察了葫芦素E对哮喘小鼠肺部炎症的影响。结果表明，葫芦素E明显降低了哮喘小鼠BALF的炎症细胞数量、抑制了肺组织炎症反应。本研究结果显示，葫芦素E明显减轻了OVA诱导小鼠的肺泡损伤。既往研究也显示葫芦素E对炎症具有一定疗效，王力先等［7］发现葫芦素E具有潜在免疫调节作用。乔静等［8］发现葫芦素E对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应有影响。

细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ在慢性变应性炎症的进展中是必需的。据我们所知，过敏性哮喘表现为Th2细胞活性被激活，Th1细胞活性降低，发病机制为Th1/Th2细胞因子失衡［9］。Th2细胞释放IL-4、IL-5和IL-13等Th2型细胞因子，促进哮喘的发展。然而，Th1细胞因子，如IFN-γ，则抑制了哮喘气道炎症反应。结果表明，葫芦素E能明显降低BALF中IL-4、IL-5和IL-13的含量，提高IFN-γ的含量。因此，葫芦素E可能通过诱导Th1/Th2平衡免疫反应而减轻哮喘小鼠气道炎症反应。

Figure 5.The effect of CuEon NF-κBsignaling activity in the lung tissues of mice（×100）.A：p-p65 protein level was determined by Western blot；B：p-p65 protein expression was detected by immunohistochemical staining.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs model group.图5 葫芦素E对小鼠肺组织NF-κB信号通路活性的影响

研究显示，MAPKs和NF-κB信号通路的激活在哮喘发病过程中发挥作用。MAPKs信号通路在炎症反应中发挥重要作用，MAPKs信号通路主要包括JNK、ERK1/2和p38 MAPK介导的3条级联反应。有研究表明哮喘动物MAPKs信号通路较正常动物活性增强。本研究显示，模型组小鼠肺部p-JNK、p-ERK1/2及p-p38 MAPK含量较正常组明显升高，这与既往报道相一致［10］。本研究中，高剂量葫芦素E组明显降低了哮喘小鼠肺部p-JNK、p-ERK1/2及pp38 MAPK含量，表明高剂量葫芦素E可抑制OVA诱导的MAPK信号通路过度激活。目前已知，p38是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员，它可由LPS、渗透性应激和紫外线照射而激活。活化的p38 MAPK可磷酸化IκB，导致IκB降解，进而激活NF-κB。其它研究也显示哮喘动物NF-κB通路活性较正常动物增加［11］，与本研究结果一致。本研究显示，模型组p-p65表达升高，表明NF-κB通路激活，高剂量葫芦素E使哮喘小鼠p-p65表达较模型组明显降低，表明葫芦素E可明显抑制NF-κB通路活性。

如前所述，OVA引起了小鼠炎性因子分泌以及MAPKs/NF-κB信号通路激活。与文献报道一致，上述炎症因子的过度分泌及通路的激活，可引起肺部炎症加剧，肺泡损伤，并引起气道重塑［12］。针对此，大量研究以药物对哮喘进行干预，旨在降低炎症因子的过度分泌及MAPKs/NF-κB信号通路的过度激活。结果表明，能作用于上述靶点的药物，可明显减轻哮喘病变。

Shang等［13］发现葫芦素 E 通过抑制 HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路，减轻脂多糖诱发的支气管上皮细胞损伤、炎症和MUC5AC的表达。本文进行了动物实验。这样，使葫芦素E在哮喘中作用的研究更具有说服力。葫芦素E对哮喘中的MAPK信号通路的影响是这篇文章中没有进行论述的。本研究中，葫芦素E明显降低了OVA引起的炎症因子分泌及MAPKs/NF-κB信号通路激活，同时减轻了小鼠肺部炎症以及肺泡损伤，理论上推测小鼠哮喘的好转可能与葫芦素E抑制炎症因子水平及MAPKs/NF-κB信号通路有关。在既往报道中，虽然有众多的中药提取物表现出了一定的抗哮喘作用，但与阳性对照药地塞米松比较，多数提取物均未达到或优于地塞米松的疗效［14］。与此类似，本研究中葫芦素E虽然明显抑制了炎症因子分泌及MAPKs/NF-κB信号通路活性，但其各数据仍未达到正常水平。因此，葫芦素E仅有部分缓解哮喘气道炎症作用。

总之，葫芦素E可明显缓解哮喘小鼠肺部炎症反应，同时抑制了MAPKs和NF-κB信号通路活性。故推测，葫芦素E减轻哮喘小鼠气道炎症与抑制MAPKs/NF-κB信号通路有关。