三种地生兰根际真菌的分离与检测

范继红　陈兰芬　汤久杨

摘要：选取兰属的春兰、春剑和寒兰3种地生兰，对其栽培基质中的根际真菌进行分离培养后得到3个优势菌株，并以18SDNA序列扩增鉴定为米根霉（Rhizopus oryaze）、球毛壳菌（Chaetomium lobasum）、小孢根霉（Rhizopus icrosporus），通过对兰花根系进行染色显微观察，发现兰花根与真菌共生形成的菌根结构，为兰科植物根际真菌研究提供了理论依据。

关键词：地生兰;根际真菌;分离;检测

中图分类号：S682.31         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）04-0088-03

Abstract： Three Chinese terrestrial orchids Cymbidium goeringii， Cymbidium tortisepalum Fukuy.var. longibracteatum and Cymbidium kanran were chosen to the samples for isolating and culturing rhizosphere fungi from substrates， which found and identificated three preponderant fungal strains during the storage， and which identified as Rhizopus oryaze， Chaetomium lobasum， Rhizopus icrosporus by 18SDNA sequences. It was found that the roots of orchid were mutualized with fungi to form rhizosphere structure， according to orchid roots stained and microscopical observed， so as to provide a theoretical basis for further research of orchids rhizosphere fungi.

Key words： orchid; rhizosphere fungi; separate; testing

兰科（Orchidaceae）是有花植物中最大的科，全世界兰科植物约有26 000种，广泛分布于各种陆地生态系统中[1]。菌根（Mycorrhiza）作为自然界中极为普遍和重要的共生现象，是植物在长期生存进化过程中与菌根真菌一起协同进化的产物[2]。几乎所有的兰科植物都与真菌共生，兰科菌根共生关系几乎伴随着兰科植物从种子萌发到开花结果的整个生活史[3]，大多数成年的兰科植物仍需菌根真菌提供生长所需的碳水化合物及有机质，如氨基酸、维生素等[4]。

本试验选取兰属的春兰[Cymbidium goeringii （Rchb. f.） Rchb. f.]、春剑（Cymbidium tortisepalum Fukuy. var. longibracteata）和寒兰（Cymbidium kanran）3种地生兰，对其栽培基质中的根际菌群进行分离培养得到3个优势菌株，并以18SDNA方法扩增进行鉴定。通过对兰花根系染色显微观察，发现了兰花根与真菌共生形成的菌根结构，以期为研究兰花根际真菌提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  供试植物

供试植物：春兰，采集地为贵州省黔西南州兴义市;春剑，采集地为四川省雅安市;寒兰，采集地为福建省漳州市。

1.2  栽培基质

栽培基质采用松树皮基质，采购于北京大汉园景科技有限公司，颗粒大小大约2 cm2，基质采用松树皮+草炭+珍珠岩混合，混合比例为松树皮∶草炭∶珍珠岩=1∶1∶1。

1.3  种苗栽培

栽植盆选用塑料盆，规格为上口径15 cm，盆底直径12 cm，高15 cm，栽培前修剪烂根、空根，待根系变软发白后再栽入盆中，每10 d浇水一次，每隔一月浇一次花多多氮磷钾三元复合肥（氮∶磷∶钾为20∶20∶20）营养液。

1.4  试验方法

菌种分离Czapek培养基，根际菌种类型鉴定采用18SDNA序列测序，菌根侵染状况采用KOH透明-蓝墨水染色法测定，菌根侵染率以被侵染的根段数占镜检总根段数的百分率表示。

2  结果与分析

2.1  3种国兰栽培基质根际菌种分离

通过Czapek培养基接种培养，发现3种优势菌株，将3种优势菌株分离培养后进行18SDNA序列测序，确定3个优势菌株分别为米根霉（Rhizopus oryaze）、小孢根霉（Rhizopus icrosporus）、球毛壳菌（Chaetomium lobasum）（表1、图1）。从表1可以看出，春兰、春剑、寒兰3种国兰均发现了米根霉，属于优势菌种;在春兰和寒兰中都分离出了球毛壳菌，可以归为亚优势种或伴生种;小孢根霉仅在春剑中发现，需要进一步试验确认其在兰花生长中的作用。从图1可以看出，在对菌种培养过程中，每种培养基上都出现了2种不同的菌落，春兰和寒兰均以米根霉白色菌丝为主，春剑中米根霉和小孢根霉分布比较平均。

2.2  3种国兰根内菌根结构及侵染率观察

通过取样镜檢发现，3种兰花的根系都发现了菌根结构，春兰发现的菌根结构主要为细胞内的聚生结构，数量较多，春剑和寒兰的菌根结构主要发现的是细胞间菌丝较多，菌丝粗大，分支不明显，在与细胞的侵染点处有明显的分支。通过镜检计数，春兰的菌根感染率比较高，达到35%（图2至图4）。

通过镜检计数，3种国兰的菌根侵染率均在30%以上，其中春兰的菌根感染率比较高，达到35%，寒兰的菌根感染率为32%，春剑的菌根感染率为30%。

3  小结与讨论

兰科植物是典型的菌根植物，不仅在种子萌发阶段与真菌有着密不可分的联系，在幼苗和成年期仍需要真菌为其提供营养，兰科植物在生长的不同时期需要不同的真菌与其共生。

本试验分离出的3个菌株都属于腐生菌类的根霉属和毛壳菌属，根霉属为毛霉科真菌中的一个大属，广泛分布于酒曲、植物残体、腐败有机物、动物粪便和土壤中，还没发现关于根霉与兰花形成的菌根。毛壳菌属是腐生子囊菌中数量最多和意义较大的类群之一，毛壳菌的大多数种类都有降解纤维素的能力，某些类群还具有重要的医用价值，已有关于从石斛兰中分离到毛壳菌的报道[5]。本试验分离到的3个菌株是否是与兰花形成的菌根有待进一步接种试验验证。

通过染色镜检观察到了兰花根系的细胞内菌丝团和胞间菌丝状况，侵染率大约都在30%左右。菌根结构简单，侵染率不是很高，可能与使用人工加工的松树皮栽培基质微生物类群简单有关。

参考文献：

[1] 盖雪鸽，邢晓科，郭顺星.兰科菌根的生态学研究进展[J].菌物学报，2014，33（4）：753-767.

[2] 李晓林，冯  固.丛枝菌根生理生态[M].北京：华文出版社，2001.

[3] DEARNALEY J D W. Further advances in orchid mycorrhizal research[J].Mycorrhiza，2007，17： 475-486.

[4] SMITH S E，READ D. Mycorrhizal symbiosis，3rd edition[M].New York：Elsevier，2008.

[5] 李  明.兰花菌根研究及应用[M].昆明：云南大学出版社，2006.