利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性

赵丹丹 杨龙 黄兆峰

摘要 β-甘露聚糖酶是种子萌发过程中降解胚乳细胞壁的关键酶，明确其活性的动态变化可为揭示杂草种子的休眠萌发机制提供重要依据。以外来杂草刺萼龙葵Solanum rostratum Dunal种子为材料，建立了种子中β-甘露聚糖酶活性的检测方法—凝胶扩散法。利用凝胶扩散法对不同贮存时间及贮存条件下刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性进行了检测，发现贮存3年以上的种子中该酶的活性为0.03 nmol/（min·mg），显著低于贮存3年以下的种子中的酶活性0.15 nmol/（min·mg），而湿润冷藏的种子中β-甘露聚糖酶的活性为0.12 nmol/（min·mg），显著高于干燥冷藏的种子的酶活性0.02 nmol/（min·mg）。实际应用结果表明，凝胶扩散法综合了传统方法的优势，检测特异性强、灵敏度高、重复性好，可同时检测大量种子样品，具有良好的实用性。

关键词 刺萼龙葵; β-甘露聚糖酶; 种子; 凝胶扩散法

中图分类号： S 451.0  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2019027

Abstract Endo-β-mannanase （EBM） is a key enzyme in degradation of endosperm cell walls during seed germination process. Understanding the dynamics of EBM activities will provide important guidance for elucidating the mechanisms of weed seed dormancy and germination. For determination of EBM activity in seeds of an invasive plant， Solanum rostratum Dunal （buffalobur）， a gel diffusion assay was established. The EBM activities in buffalobur seeds with different storage time and under different storage conditions were detected by this method. The results showed that the EBM activity in seeds stored longer than 3 years [0.03 nmol/（min·mg）] was significantly lower than that of seeds stored less than 3 years [0.15 nmol/（min·mg）]. Whereas for seeds stored wet in the refrigerator [0.12 nmol/（min·mg）]， the EBM activity was significantly higher than that of seeds stored dry in the refrigerator [0.02 nmol/（min·mg）]. The practical application verified that the gel diffusion assay， which took advantages of traditional methods， was a specific， highly sensitive and reproducible method， and could analyze a large number of seed samples simultaneously.

Key words Solanum rostratum; endo-β-mannanase; seed; gel diffusion assay

種子是杂草发生危害的根源和传播扩散的重要载体，关系到种群的生存和发展[1-2]。种子内通常存在细胞壁加厚的胚乳细胞，可以阻碍胚根突破种皮，其细胞壁的降解是种子萌发的前提。β-甘露聚糖酶是降解胚乳细胞壁主要成分半乳甘露聚糖的关键酶，明确其活性的动态变化对揭示杂草种子的萌发调控机理，进而制定有针对性的杂草综合防控措施具有重要意义。半乳甘露聚糖是大多数种子胚乳细胞壁的主要成分，在茄科植物种子中可达60%[3-4]。研究表明，β-甘露聚糖酶在番茄、莴苣、曼陀罗[5-7]等植物的种子萌发过程中发挥着重要作用，主要水解甘露聚糖主链之间的β-1，4共价键，侧链及水解产物可由同工酶α-半乳糖苷酶及β-甘露糖苷酶协同降解[3，8]。由于β-甘露聚糖酶与种子的休眠萌发密切相关，其在20世纪70年代已引起国内外的广泛关注，我国对该酶的研究主要集中在微生物发酵和饲料添加剂方面，在植物种子中的相关研究则较少[9-11]。

种子中β-甘露聚糖酶活性的检测是研究甘露聚糖酶的关键，其活性受内外因素影响较大，检测结果也易受β-甘露聚糖酶同工酶α-半乳糖苷酶及β-甘露糖苷酶的影响。传统β-甘露聚糖酶活性的测定主要有黏度测定法和分光光度法，前者准确度较高，但操作繁琐、耗时长;后者对部分种子测定效果好，但通用性差、准确度低[12]。β-甘露聚糖酶对调控种子的萌发具有重要作用，明确种子萌发过程中β-甘露聚糖酶活性的动态变化，可为揭示外来杂草刺萼龙葵Solanum rostratum Dunal种子的休眠萌发机制提供依据。采用传统方法测定β-甘露聚糖酶活性时适用性和效率不高，因此有必要建立一种可靠、有效的检测方法。本研究以刺萼龙葵种子为研究对象，基于Downie等[13]和Still等[14]的凝胶扩散法，拟优化建立一种灵敏度高、操作简便的测定方法，实现对种子中β-甘露聚糖酶活性的准确和高效检测。

1 材料与方法

1.1 种子来源与处理

2007年-2011年连续5年在北京采集成熟刺萼龙葵种子，并对2007年种子分别采用湿润冷藏（4℃）、干燥冷藏（4℃）和室温干燥（25℃）3种贮存方式备用。待测种子处理时2007年-2011年贮存的种子相应的贮存年限为5年～1年。剔除有机械损伤的种子和杂物，每处理选取30粒种子用蒸馏水反复冲洗3次、1%次氯酸钠浸泡10 min，再将种子转移至垫有两层滤纸、含5 mL蒸馏水的直径为9 cm的培养皿中，置于培养箱内30℃、黑暗条件下培养。分别选取相同培养时间的种子进行β-甘露聚糖酶活性的测定。

1.2 凝胶扩散法基本方法与原理

将含有β-甘露聚糖酶的种子粗酶提取液置于含有该酶专一性底物-甘露聚糖的琼脂糖培养基中，通过粗酶提取液中的β-甘露聚糖酶与底物接触，培养催化种子粗酶液水解底物。由于β-甘露聚糖酶的水解作用可使水解后的底物与染色剂刚果红的结合能力丧失，利用底物与刚果红结合能力的差异进行染色，可在凝胶上形成明显的透明消化圈。根据透明消化圈直径大小与β-甘露聚糖酶活性的线性关系，可以确定待测种子中酶活性的强弱[13，15]。

1.3 刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶活性的测定

参照Downie等[13]和Still等[14]的凝胶扩散法，按照以下试验步骤进行刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶活力的测定。

1.3.1 凝胶制作

用0.2 mol/L磷酸氢二钠-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH=5）配制浓度为0.05%（m/V） LBG（Locust bean gum）溶液，置于95℃的水浴锅中保温并搅拌30 min，随后停止加热，冷却并将悬浮液转移至50 mL离心管中，于4℃、11 000 g离心15 min。取离心后上清液配制0.8%（m/V）的琼脂糖溶液，微波加热溶解，冷却至65℃左右，取27 mL上述溶液倒入水平放置的规格为100 mm×100 mm×15 mm的一次性方形培养皿中，凝胶厚度为5 mm。室温下聚合1 h后，用直径为2 mm的凝胶打孔器在培养皿内的凝胶上均匀打36孔，移除孔中残留的凝胶，封闭培养皿保湿备用。

1.3.2 种子中β-甘露聚糖酶粗酶液的提取

针对不同贮存时间和贮存方式的刺萼龙葵种子，各取培养5 d的种子30粒，用解剖刀将种子的胚（含胚乳，去除种皮）逐一分离，用研钵碾碎并转移至1.5 mL离心管中，加入300 μL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=5），于30℃黑暗孵育培养2 h，得到含β-甘露聚糖酶的种子粗酶液。

1.3.3 水解反应

分别向制好的培养皿凝胶小孔中加入2 μL含β-甘露聚糖酶的种子粗酶液上清液，以等体积的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=5）为对照，然后用封口膜密封培养皿并将其转移至具盖白瓷盘，瓷盘中放入单层滤纸并加适量的蒸馏水保持湿度（必要时可补加蒸馏水），密闭瓷盘，于30℃黑暗条件下保温、保湿处理20 h。

1.3.4 刚果红显色

取出經保温、保湿处理后的培养皿，加入10 mL 0.5%（m/V）的刚果红染色液，置于水平摇床60 r/min、30℃染色20 min，移出染色液，蒸馏水轻柔洗涤1 min，接着将凝胶用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=7）缓慢振荡洗涤1～2 min，可清楚地显示出水解消化圈，然后用80%乙醇洗涤使消化圈边缘清晰。将显色凝胶置于扫描仪（EPSON STD 4800）中进行图像扫描，消化圈直径利用WinSeedle系统进行测量。

1.3.5 β-甘露聚糖酶标准曲线的制作

为建立β-甘露聚糖酶活性与底物消化圈直径间的定量关系曲线，将β-甘露聚糖酶标准品（酶活性46 U/mg，Megazyme公司）用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=5）梯度稀释至5 000、50 000、100 000、200 000、400 000、800 000、1 600 000倍。分别取2 μL稀释的标准β-甘露聚糖酶酶液，以稀释所用的缓冲液为对照，按1.3.3、1.3.4的步骤进行水解和刚果红显色反应。根据β-甘露聚糖酶标准品说明及酶活性相关规定[16]，酶活性单位U定义为：在一定条件下每分钟水解底物甘露聚糖形成1 μmol甘露糖时所需的β-甘露聚糖酶为1个酶活性单位，即1 U=1 μmol/（min·mg）=1 000 nmol/（min·mg）。β-甘露聚糖酶标准品的活性为46 000 nmol/（min·mg），则梯度稀释后的酶活性依次为9.2、0.92、0.46、0.23、0.115、0.057 5、0.028 75 nmol/（min·mg）。以水解消化圈的直径为横坐标，不同稀释倍数的标准β-甘露聚糖酶的活性为纵坐标作图，拟合方程可得β-甘露聚糖酶的标准曲线。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的拟合和建立

不同稀释倍数的标准β-甘露聚糖酶可在含专一性底物甘露聚糖的凝胶上水解产生不同大小的透明消化圈，消化圈直径与酶活性呈显著的正相关，酶活性越高消化圈直径越大，酶活性越低则消化圈直径越小。对不同标准β-甘露聚糖酶的梯度酶活性与消化圈直径进行线性拟合，分析比较不同的拟合方程，发现底物消化圈直径（x）与酶活性（y）的拟合曲线为指数方程时效果最佳，据此建立了相关的标准曲线方程为y=0.004 1e0.392 6x（R2=0.967） （图1）。

2.2 刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶活性的检测

2.2.1 贮存时间对β-甘露聚糖酶活性的影响

应用改进的凝胶扩散法测定了不同贮存时间的刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性。结果表明，种子中β-甘露聚糖酶的活性随贮存时间的增加呈现下降的趋势，其中贮存5年（2007年）的种子中该酶的活性为0.03 nmol/（min·mg），显著低于贮存1年（2011年）的种子中酶的活性0.15 nmol/（min·mg）。总体来看，贮存3年以内的种子（2009年-2011年）中β-甘露聚糖酶的活性差异不显著，但均显著高于贮存3年以上的种子中该酶的活性，说明刺萼龙葵种子贮存3年以后，种子中β-甘露聚糖酶的活性开始出现显著降低（图2）。

2.2.2 贮存条件对β-甘露聚糖酶活性的影响

对不同贮存条件下刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性进行了测定，结果表明，不同处理间种子中β-甘露聚糖酶的活性存在显著差异。湿润冷藏的种子中该酶活性为0.12 nmol/（min·mg），高于干燥冷藏和干燥室温贮存的种子中的酶活性，后二者分别为0.02和0.03 nmol/（min·mg）（图3）。从以上结果可以看出，贮存条件会显著影响刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性，进而影响其种子的休眠萌发特性。

3 讨论

已有研究表明，β-甘露聚糖酶与植物种子休眠萌发密切相关，在种子细胞壁的降解和休眠解除方面具有重要作用[5，17-18]。明确β-甘露聚糖酶影响杂草种子休眠和萌发的机制，对杂草发生和出苗进行预测和合理调控，将为杂草的综合治理提供重要依据[19]。建立可靠、有效的种子中β-甘露聚糖酶活性检测方法，是开展相关研究的关键。

分光光度法（即DNS法）主要利用3，5-二硝基水杨酸与还原糖在碱性条件下的颜色反应，对β-甘露聚糖酶活力进行测定。该方法尽管测定流程较为简单，但由于种子粗酶液中除了β-甘露聚糖酶外，还同时存在同工酶α-半乳糖苷酶及β-甘露糖苷酶，可以对β-甘露聚糖酶水解产物进一步消化产生还原糖，造成测定结果不准确[3，12，20]。黏度测定法利用底物消化反应前后黏度的变化，对β-甘露聚糖酶活力进行测定。尽管可检测到较低的酶活，但同样易受β-甘露聚糖酶的同工酶影响，并且样品逐一检测，效率较低[15]。因而上述两种传统方法在测定β-甘露聚糖酶的实际应用过程中均受到不同程度的限制。

与传统方法相比，凝胶扩散法采用了刚果红显色和专一性底物LBG，可降低种子粗酶液中同工酶的干扰，特异性强，降低了实验误差。凝胶扩散法检测灵敏度高，可检测稀释至160万倍的标准酶活力0.029 nmol/（min·mg），且检测过程中重复性好，可同时对大批量种子样品进行酶活性测定，检测成本较低、效率较高。凝胶扩散法综合了传统分光光度法效率较高和黏度测定法灵敏度较高的优势，准确可靠，具有较好的实用和推广价值。由于种子大小及胚和胚乳成分不同，凝胶扩散法是否可用于其他种子中β-甘露聚糖酶活性的检测，不同种子的反应体系是否应做相应调整，还有待进一步的研究。

4 结论

本研究建立了检测外来杂草刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶活性的凝胶扩散法，可同时检测多个种子样品，检测方法灵敏度高、重复性好，具有良好的实用性。该方法的建立为不同贮存时间和贮存条件下刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶活性的检测提供了技术支撑，为刺萼龙葵种子休眠水平的动态监测及其种子季节性休眠机制的阐明提供了科学的参考依据。

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（责任编辑： 田 喆）