四神丸对脾肾阳虚型IBS-D大鼠结肠CRF表达的影响

蔺晓源，邓 娜，龙红萍，夏旭婷，蔡 莹，刘富林*

（1.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007；2.湖南中医药大学，长沙 410208）

腹泻型肠易激综合征（IBS-D）以反复发作的腹痛、腹泻为主要表现，属中医“泄泻”的范畴[1]。IBS-D的发病机制尚不明确，至今亦无最佳治疗方案，虽然不会严重威胁人体生命，但其症状迁延反复，对患者生活质量的影响远比器质性疾病更严重[2]。目前一致认为，脑肠轴调控紊乱在IBS-D的发病中起主要作用。促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）是脑肠轴在应激反应系统中重要的脑肠肽，CRF及其受体在胃肠道中广泛分布，并在IBS-D的发病中起关键作用[3]。四神丸是主治脾肾阳虚泄泻的经典名方，临床用于治疗IBS-D效果显著[4-5]。为了进一步明确四神丸发挥疗效的作用靶点，本研究观察了其对脾肾阳虚型IBS-D模型大鼠CRF的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物 SD大鼠40只，SPF级，雄性，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2013-0004。饲养于SPF级实验动物房，饲养温度 21～25 ℃，湿度50%～70%。所有大鼠自由饮水、进食，每2天更换1次垫料。

四神丸[北京同仁堂天然药物（唐山）有限公司，国药准字Z13020656]，研碎后过筛，用蒸馏水配制，浓缩成0.732 g/mL浓度混悬液。得舒特（匹维溴铵片，法国苏威制药公司，注册证号H20120127），研碎后过筛，配制成1.523 mg/mL药液。番泻叶（购于湖南中医药大学第一附属医院中药药房，符合2015版《中国药典》标准）按100 g加沸水400 mL的比例，先浸泡30 min，再煮10 min，去滓，浓缩成1.0 g/mL水煎液。

1.2 主要试剂与仪器 大鼠CRF ELISA试剂盒（RD公司），CRF兔抗多克隆抗体（abcam），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Bio-Swamp），蛋白质Marker(Thermo)，逆转录试剂盒（TAKARA），PCR试剂盒（KAPA Biosystems）。Enspire多功能酶标仪（Perkinelmer），Z32HK高速冷冻离心机（Hermle），RM2235石蜡切片机（Leica），IX71显微镜和图像分析系统（奥林巴斯），Realplex2荧光定量PCR仪（Eppendorf），Mini Protean tetra cell蛋白印记系统、T100梯度PCR扩增仪、CheemiDoc XRS+Imager化学发光系统（美国BIO-RAD）。

1.3 动物分组与模型制备 将40只大鼠先按体质量用随机数字法分为2组，空白组（10只）和造模组（30只）。造模组参考文献[6-7]方法采用番泻叶灌胃+避水应激方法建立脾肾阳虚型IBS-D大鼠模型：造模动物给予番泻叶水煎液灌胃（10 mL/kg），每天1次，连续28天后开始进行避水应激；取一透明玻璃水槽（60 cm长×30 cm宽×40 cm高），中央有一岛样小平台（10 cm长×10 cm宽×10 cm高），水槽内注满水，距平台面下1 cm，每天上午9:00 — 11:00将造模大鼠置于平台上，每天1 h，连续10 d。待模型复制成功后再将造模组随机分为3组，分别为模型组、得舒特组和四神丸组，每组10只。

1.4 给药方法与标本取材 四神丸组大鼠每日按7.32 g/（kg·d）剂量灌胃（相当于成人等效剂量的4倍，课题组前期研究结果已证实4倍剂量效果最优），得舒特组按15.23 mg/（kg·d）剂量（成人等效剂量）给予得舒特水溶液，模型组给予等容量蒸馏水，正常组常规喂养。灌胃体积量均为10 mL/kg，给药14 d。

大鼠在最后1次灌胃后水合氯醛麻醉，冰盒上心脏采血，静置20 min离心，取上层血清入-20℃冰箱保存；剖开腹腔剪取距离肛门10 cm处的末端结肠，其中一小段用生理盐水漂洗后装入冻存管中置-80℃冰箱中保存，另一小段放入多聚甲醛中固定。

1.5 指标检测

1.5.1 ELISA 检测血清CRF的含量变化 依次按ELISA试剂盒所提供的方法，进行标准品的稀释与加样、温育30 min，20倍蒸馏水稀释浓缩洗涤液、洗涤，加入酶标试剂50 uL，再次温育、洗涤，后加入显色剂A、B各50 uL显色15 min，中止液中止，酶标仪450 nm波长测量各孔的OD值。建立标准曲线的直线回归方程式，计算出样品浓度。

1.5.2 免疫组化法检测结肠组织CRF的阳性表达 每组随机取出5个标本，流水冲洗，不同浓度的乙醇逐级脱水，置入纯乙醇和二甲苯的等体积混合液中透明，石蜡包埋切片，一抗（CRF抗体）孵育，maxvision二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，透明、封片。使用400倍镜选取阳性表达不重复的5个视野拍片，最后用图像分析系统分析CRF阳性染色的平均OD值。

1.5.3 Western Blot检测结肠组织CRF的蛋白表达 每组随机取出5个标本，按每20 mg组织加入150～250 μL裂解液提取蛋白，使用酶标法进行蛋白定量，制备SDS-PAGE胶，每孔上样10 ug蛋白，经电泳、湿转膜、5 %脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗（CRF抗体) 室温孵育1 h、1:10000稀释HRP 标记的二抗室温孵育1 h，显色后将膜置于化学发光系统中检测。

1.5.4 RT-PCR检测结肠组织CRF的mRNA 表达 每组随机取出3个标本，根据RT-PCR的操作方法进行组织总RNA的提取、cDNA 第一条链的合成（总RNA中DNA的消除；总RNA中DNase1 的消除；反转录：42 ℃，60 min；70 ℃，15 min；16 ℃，hold）和PCR扩增。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列：CRF-F：TGGATCTCACCTTCCACCTTCTG，CRF-R：CCGATAATCTCCATCAGTTTCCTG；GAPDH-F：CCTTCCGTGTTCCTAC，GAPDH-R：GACAACCTGGTCCTCA。数据采用仪器自带软件分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据分析。资料以均数±标准差（±s）表示，多组间的比较满足正态性检验后，方差齐时采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，方差不齐时采用Tamhane’s T2 法。不满足正态性分布的采用非参数检验。P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四神丸对模型大鼠血清中CRF水平的影响 空白组、模型组、得舒特组和四神丸组血清中CRF含量分别为（81.39±9.46）ng/L、（117.07±11.24）ng/L、（93.55±9.82）ng/L、（87.40±8.73）ng/L。与空白组比较，模型组血清CRF含量增高（P＜0.01）；与模型组比较，四神丸组和得舒特组血清CRF含量均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 四神丸对模型大鼠结肠组织中CRF阳性表达的影响 CRF在结肠中的免疫阳性表达以胞膜和胞浆内呈棕黄色颗粒染色。与空白组比较，模型组结肠CRF的阳性表达增加（P＜0.01）；四神丸组和得舒特组结肠CRF的阳性表达均明显减少，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1，图1。

表1 各组大鼠结肠组织CRF表达比较（±s，n=5）

表1 各组大鼠结肠组织CRF表达比较（±s，n=5）

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与得舒特组比较，▲P＜0.05

图1 各组大鼠结肠组织CRF免疫组化染色结果（×400）

2.3 四神丸对模型大鼠结肠组织中CRF蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组结肠CRF的蛋白表达升高（P＜0.01）；四神丸组和得舒特组结肠CRF的蛋白表达均明显降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01），且四神丸组低于得舒特组（P＜0.05）。见表1、图2。

图2 各组大鼠结肠CRF蛋白免疫印迹电泳图

2.4 四神丸对模型大鼠结肠组织中CRFmRNA表达的影响 见图3。

图3 各组大鼠结肠CRFmRNA表达柱状图

3 讨论

IBS-D是一种与个体心理状态有关的慢性心身疾病[8]，脑肠轴调控障碍在IBS-D的发病中起着非常重要的作用，通过兼具神经递质与内分泌激素双重身份的脑肠肽在外周和中枢水平形成一个协调统一的整体，调节着胃肠运动、感觉、分泌等复杂功能[9-10]。IBS-D大鼠结肠CRF的含量、阳性表达及其mRNA表达升高，可能是IBS-D结肠运动异常和内脏高敏感性的作用机制之一[11]。因此，CRF是导致IBS-D发生的重要效应因子，其在应激诱发的肠道动力改变中起关键作用。

泄泻病位在肠，脾失健运是其关键，同时与肾脏密切相关[12]。《灵枢·邪气脏腑病形》曰：“肾脉小甚为洞泄”。在此认识的基础上，后世提出了脾肾阳虚的五更泄泻。我们通过研究泄泻的中医证型及其证候分布规律表明，脾肾阳虚证在泄泻中的证型比例为9.21%[13]。基于“脾肾相关”理论，治当益火补土。《内科摘要》所载四神丸为治疗脾肾阳虚型泄泻的经典名方。方中重用补骨脂为君，温肾助阳，壮火益土，暖脾止泻；臣以肉豆蔻温中涩肠；佐以吴茱萸助阳止泻，五味子收敛固涩。本方配伍精，药味少，药力专，应用广。众多研究报道，四神丸临床用于治疗IBS-D效果显著，我们的Meta分析结果也表明，四神丸治疗IBS-D临床有效率优于西药组，且四神丸安全性更高[14]。课题组前期研究发现，四神丸对脾肾阳虚泄泻模型大鼠的作用机制可能与调节脑肠肽Ghrelin信号通路指标的表达有关[15-17]。

本研究结果显示，模型组大鼠血清中CRF的含量升高，结肠组织CRF的阳性表达，及其蛋白和mRNA的表达均较空白组正常大鼠升高，说明应激致IBS-D大鼠出现CRF的水平紊乱。经给药治疗后，四神丸组大鼠血清中CRF的含量降低，结肠组织CRF的阳性表达减少，CRF的蛋白和mRNA表达降低，与模型组比较均有统计学差异，说明四神丸能明显调节IBS-D大鼠CRF水平。四神丸组结肠CRF的蛋白表达明显低于得舒特组，说明具有多靶点调节作用的四神丸对CRF的调节作用优于西药。以上研究结果表明，四神丸对脾肾阳虚型IBS-D大鼠的作用可能与降低CRF的水平和表达有关，这可能是其治疗IBS-D的作用靶点之一。