基于证素辨证的绝经后骨质疏松症代谢组学研究

李肖飞，徐琬梨

（山东中医药大学，济南 250355）

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis,PMOP）是由于女性在绝经后激素水平快速下降从而导致骨含量降低而出现的。绝经后骨质疏松症是女性需要重点关注的疾病，其对女性的健康存在重要的影响，引起了社会上的广泛关注。本文对绝经后骨质疏松症患者的常见证素以及正常对照组进行代谢组学分析，以期为绝经后骨质疏松症的临床诊断及预防提供生物学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集在山东中医大学附属医院山东省中医院骨科2016年12月－2017年10月住院并测定骨密度确定为骨质疏松症的患者，并通过证候辨证素量表测得绝经后骨质疏松症常见实性证素（肾虚组、痰湿组、肾虚气滞组、肾虚痰湿组、肾虚血瘀组），以及空白对照组患者。各组在年龄、性别、绝经年龄等方面比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 诊断标准 参照《原发性骨质疏松指南（2017）》[1]拟定。1）女性绝经1年以上；2）骨质疏松症诊断主要参考脆性骨折程度或DXA骨密度测量结果，T-值≤-2.5可诊断为骨质疏松；3）既往无糖尿病、甲亢、甲旁亢等影响骨代谢性疾病、血液系统疾病、慢性肝肾功能不全、恶性肿瘤疾病史及无长期接受糖皮质激素及免疫抑制剂治疗。

1.3 证素诊断标准 根据中医理论和辨证思维规律，参照《证素辨证学》[2]，根据中医诊断整体审察、四诊合参的原则，对证候、证素进行文献查阅、数据分析，对其2者所存在的从属关系，进行量化标值，从而制定出“证候辨证素量表”。通过临床信息采集对患者进行量表的测评，根据四诊进行判断各个证候，以明确在证素诊断中所占的评分比重，以各证候的评分总分来确定证素。取病位证素肾，以肾虚为主要临床表现，综合实性证素血瘀、气滞、痰湿，分为肾虚组、痰湿组、肾虚血瘀组、肾虚气滞组、肾虚痰湿组，每组各30例。

1.4 血清采样方法 晨时空腹取血，室温下离心5 min后取血清，至-80℃的冰箱进行分组储存。

1.5 样本预处理 将血样样本在室温下解冻，取血样样本400 μL放于1.5 mL离心管中，加入30 μL缓冲液和170 μL水，斡旋混匀，震荡混匀后在4 ℃的条件下离心10 min，取500 μL上清液至核磁管中待检。

1.6 H-NMR数据采集及处理 H-NMR 实验所用仪器是Varian 600MHz 谱仪，其1H共振频率是599.93 MHz。横向弛豫加权实验是用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列，弛豫延迟2.0 s，采集时间1.5 s，谱宽12 000.0 Hz，温度25 ℃，总回波时间100 ms，累加次数64次。

1.7 统计学方法 采用MestReNova 9.0.1对H-NMR采集处理的数据进行分析，进行多元统计分析，主要包括主成分分析（PCA），进一步用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）优化组间差异，通过对OPLS-DA模型各代谢物相应的相关系数分析，对有统计意义的差异代谢物进行进一步归纳。

2 结果

2.1 H-NMR谱图预处理 对各组血清的谱图使用MestReNova V9.0.1进行相位调整、傅立叶变换、基线定标及校正等处理[3]，结果显示见图1。通过分析图谱可知各组之间存在差异代谢物，继续采用多元统计方法进行分析，包括PCA、PLS-DA和OPLS-DA。

本研究中主要研究A、C、D、E、F组之间的差异。通过检索代谢组学H-NMR谱相关化学位移谱数据库，可知各组血清的差异代谢物主要如下。1-MH：1-甲基丁酸；3-HB：3-羟基丁酸；AA：乙酰乙酸；Ace：乙酸；Act：内酯；Ala：丙氨酸；Cho：胆碱；Cit：柠檬酸；Cr：肌酸；DMA：二甲基赖氨酸；DMG：N，N-二甲基甘氨酸；EA：乙醇胺；Eth：乙醇；For：甲酸；Glc：葡萄糖；Gln：谷氨酰胺；Glu：谷氨酸；Gly：甘氨酸；G：丙三醇l；GPC：甘油磷酸胆碱；HDL：高密度脂蛋白；HX：次黄嘌呤；IB：异丁酸；Ile：异亮氨酸；L1：低密度脂蛋白,CH3-（CH2）n-；L2：极低密度脂蛋白，CH3-（CH2）n-；L3：低密度脂蛋白，CH3-（CH2）n-；L4：极低密度脂蛋白，CH3-（CH2）n-；L5：极低密度脂蛋白，-CH2-CH2-C=O；L6：脂质，-CH2-CH=CH-；L7：脂质，-CH2-C=O；L8：脂质，=CH-CH2-CH=；L9：脂质，-CH=CH-；Lac：乳酸盐；Leu： 亮氨酸；Lys：赖氨酸；M： 丙二酸；Met： 甲硫氨酸；Mol： 甲醇；m-I：肌醇；NAG：N-乙酰糖蛋白；PC：磷酸胆碱；Phe： 苯丙氨酸；Py：丙酮酸；Sar： 肌氨酸；Suc：琥珀酸盐；Thr：苏氨酸；TMAO： 三甲胺；Tyr： 酪氨酸；Val： 缬氨酸。

2.2 主要成分分析 PCA可以更好的揭示各组的内部结构，从而更明确的说明各组数据变量。使用SIMCA 14.1，对实性证素各组结果进行对数（LOG）转换加UV格式化处理，然后进行自动建模分析[4]。从A、F组，A、E组，A、D组，A、C组之间PCA得分图的结果可以看出，2组样本区分不显著，样本大部分处于99%置信区间（Hotelling’s T-squared ellipse）内，此数据值得进一步研究。

2.3 正交偏最小二乘法一判别分析（PLS-DA）及对模型的验证 为了实验结果的可视化和后续分析，采用OPLS-DA的方法进行进一步的数据分析。使用SIMCA 14.1对数据进行LOG转换加UV格式化处理[5-6]，表明各组之间模型可靠，并且各组血清代谢模式发生改变。可知C、A组，D、A组，E、A组，F、A组各组之间的置换检验结果表明各组模型的R2接近1，表明建立的模型符合样本数据的真实情况Q2接近1，说明如果有新样本加入模型，会得到近似的分布情况，总的来说各组的原模型可以很好地解释2组样本之间的差异。

图1 各组血清谱峰归属图

2.4 差异代谢物的筛选 通过对OPLS-DA模型各代谢物相应的相关系数分析，对有统计意义的代谢物进行进一步归纳。对数据进一步处理时，先将相关系数图中的所有变量的Loading值乘以其标准偏差后，进行回溯转换对各组的数据，相关系数的绝对值与0.361进行对比，最终筛选获得导致各组之间存在差异的代谢产物[7-8]。见表1。

结果显示绝经后骨质疏松症的肾虚组与正常对照组，肾虚气滞组与正常对照组，肾虚血瘀组与正常对照组，肾虚痰湿组与正常对照组之间的血清代谢成份存在明显的差异。1）PMOP肾虚组与正常对照组主要的差异代谢物为乙醇胺、甲酸盐、次黄嘌呤、异亮氨酸、丙二酸盐、酪氨酸、缬氨酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖，差异具有统计学意义（P＜0.05）；2）PMOP肾虚气滞组与正常对照组主要的差异代谢物为肌酸、乙醇胺、甲酸、谷氨酰胺、异丁酸、异亮氨酸、乳酸盐、低密度脂蛋白、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸，差异具有统计学意义（P＜0.05）；3）PMOP肾虚血瘀组与正常对照组主要的差异代谢物为乙醇胺、甲酸、异丁酸、异亮氨酸、低密度脂蛋白、亮氨酸、丙二酸盐、酪氨酸、缬氨酸，差异具有统计学意义（P＜0.05）。4）PMOP肾虚痰湿组与正常对照组主要的差异代谢物为甲酸、甘油、丙酮酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 不同组对间血清主要差异代谢物及其OPLS-DA相关系数

3 讨论

通过对绝经后骨质疏松症实性证素进行HNMR的代谢组学研究，血清样本的谱图上有很多不同的尖锐谱峰，并且通过PCA、PLS-DA、OPLS-DA的分析，可知肾虚组与正常对照组，肾虚气滞组与正常对照组，肾虚血瘀组与正常对照组，肾虚痰湿组与正常对照组之间存在明显的差异代谢物。

3.1 肾虚组与正常对照组的差异代谢物分析 乙醇胺与糖酵解有关，乙醇胺是磷脂代谢的产物，磷酸是体内各种物质代谢不可缺少的物质，乙醇胺的增加说明磷脂代谢的增加，磷脂代谢与肾病糖尿病相关，其乙醇胺的增多反应其病位肾部位的病理变化[9]。亮氨酸、异亮氨酸是支链氨基酸,能够促进和抑制蛋白质合成、分解，并且参与糖代谢过程，与机体能量代谢有关[10]。低密度脂蛋白参与脂代谢的运程，与骨质疏松症的发生存在关联，其含量的降低说明体内脂代谢运程的降低。缬氨酸与体外细胞免疫有关[11]。说明肾虚组的能量代谢较慢，PMOP肾气虚患者会影响能量代谢、脂代谢的进程，肾虚证的表现与代谢物的异常相符合，并且表明PMOP肾虚患者的细胞外免疫力下降。甲酸是甲醇的代谢产物，甲醇经过肝脏的代谢生成甲酸。生成的甲酸最初会聚集于眼部，破坏视觉神经，造成视觉上的变化，后期随着身体气血循环进入血液会使组织酸性变强，进而损害肾脏，造成肾脏功能的降低。BROSNAN等[12]研究发现甲酸由多种代谢源产生，主要用于嘌呤合成，通过对叶酸缺乏大鼠甲酸盐代谢的研究表明，叶酸缺乏导致甲酸盐产生率降低，同时血浆甲酸盐浓度升高。研究[13]表明叶酸水平的升高会导致骨质疏松症的发生，因此甲酸含量的上升与骨质疏松症存在关联。

3.2 肾虚气滞组与正常对照组的差异代谢物分析 肌酸是甘氨酸的衍生物，在能量代谢上具有重要作用。其存在于肌肉中，与人体运动、力量、恢复等相关[14]。谷氨酸含量的降低与人体疼痛反应降低相关[11]。乳酸是糖异生循环中的主要原料，乳酸含量的异常说明PMOP肾虚气滞患者由于气机的阻滞使循环系统受到影响[15]。赖氨酸是所有慢性病常见的代谢物，苯丙氨酸主要在肝脏等组织中代谢成酪氨酸，参与酪氨酸降解途径[16]，其含量的异常说明PMOP是一种慢性疾病。中医学中气滞的发生多与肝脏有关，因此PMOP肾虚气滞组相比对照组会影响糖代谢、氨基酸代谢等方面，尤其在于氨基酸代谢的紊乱，并且其代谢物的异常提示对人体消炎镇痛方面存在影响。

3.3 肾虚血瘀组与正常对照组的差异代谢物分析 酪氨酸是合成儿茶酚胺类递质的前体，儿茶酚胺递质可以缓解疼痛达到消炎镇痛的目的，酪氨酸含量的异常表明PMOP患者需要该类物质来达到自身修复的作用[17]，说明PMOP血瘀组患者所表现出来的刺痛与体内酪氨酸的增多有关。PMOP肾虚血瘀组的乙醇胺的含量也是上升的，表明对于PMOP的患者的糖代谢有影响。该组低密度脂蛋白差异代谢值较其他组上升最大，LDL水平的增高说明脂代谢的异常，脂肪不完全氧化程度高，血液运行缓慢，低密度脂蛋白的上升则与血瘀证相符[18]。缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸的含量也是上升的，其都属于氨基酸代谢[19]，多于肝脏进行，同样表明血瘀的发生与肝存在联系。

3.4 肾虚痰湿组与正常对照组差异代谢物分析 葡萄糖进行有氧糖酵解，1分子的葡萄糖可以提供2 mol ATP和2分子的丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下生成乳酸，丙酮酸与人体的能量代谢相关[10]，另一方面丙酮酸与激素的形成存在关联，而PMOP发生的重要原因是激素水平紊乱，因此丙酮酸含量的异常也会导致PMOP的发生。α-葡萄糖，β-葡萄糖也是细胞能量来源的产物以及中间的代谢物[20]，说明PMOP肾虚痰湿组的糖代谢较为迅速，糖异生的过程加快，中间产生乳酸含量较低，表明一方面痰湿证会令人感到乏力，疲倦的感觉[21]。另一方面，痰湿证会阻碍布散人体所需的精微物质。

4 结论

通过对PMOP各组以及正常对照组血清的差异代谢物进行研究分析，可知PMOP各组与正常组是可以区分的，涉及19种差异代谢物，其中甲酸代谢物的变化与各组都相关，可能是PMOP较为明显的潜在生物学标志物。为PMOP的发病机理研究提供了生物学上的支持，提示在PMOP的研究中应把重点放在甲酸代谢物方面，分析其所在通路以及所涉及基因，也表明生活中出现一些疼痛以及饮食异常的情况要加以重视。本实验研究主要用的是HNMR技术，只能检测小部分血清代谢物，以后的研究中可以进一步采取CS-MS、LC-MS的检测，来提高检测的准确性，为PMOP研究发病机理提供生物学依据。