“杞月茶”对卵巢储备功能下降影响的研究及探讨

郭丽璇，李 军，张 茹，龙子临，邓 越，朱玉莹，钟炘燮，丁 霞

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

卵巢储备功能是指卵巢内存留卵泡的数量和质量，反映了女性生育能力。当卵巢内存留的可募集卵泡数目减少，卵巢产生卵子能力减弱，形成卵母细胞能力下降，包括卵泡数量和(或)质量的下降，称为卵巢储备功能下降(Decreasing Ovarian Reserve，DOR)。DOR在＞45岁女性中为正常生理现象，在40岁前则被称为病理性DOR。病理性DOR患者可无临床症状，或主要表现为周期紊乱、经期缩短、经量减少及经色黯淡，甚则闭经、不孕[1]。如不积极干预将导致卵子耗竭，由量变到质变，大约1～6年的时间内可发展为卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）[2]，严重影响患者的生活质量。DOR目前尚未有流行病学调查报道，但从临床上对患者的观察中，DOR发病率日益增高，并具年轻化趋势。流行病学研究显示，DOR在女性人群中发病率为10%[3]；卵巢早衰在一般人群中发病率为0.9%～3%，在闭经者中占2%～10%[4]；治疗上，西医采用建立人工周期疗法，但仅能改善患者症状、延缓闭经，无明显提高生育能力的疗效。中医多认为此病以肾虚为本，病机复杂，虚实夹杂。郭志强教授认为肾虚肝郁是DOR发生的主要病机，并以滋肾养肝法治疗DOR，在缓解症状及提高生育能力等方面，临床疗效显著[5-6]。本实验选取郭志强教授滋肾养肝法的君臣药物“枸杞子”“月季花”制成代茶饮“杞月茶”，利用动物实验探讨“杞月茶”对DOR的疗效，旨在研究针对DOR更便捷、普及的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雌性SD大鼠50只（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物中心提供），8周龄，体质量约200～220 g。

1.2 实验药品 1）环磷酰胺，由江苏盛迪有限公司生产，批准文号：国药准字H32020857。2）中药，枸杞子茶：枸杞子15 g，自煎，浓缩；月季花茶：月季花15 g，自煎，浓缩；杞月茶：枸杞15 g，月季花10 g，自煎，浓缩。3）芬吗通，由Abbott Biologicals B.V.公司生产，批准文号：H20150345。

1.3 实验条件 室内保持22～25 ℃，自由饮水进食，昼夜间断照明，水料充足，规律更换。

1.4 实验器材 1）倒置相差显微镜：由北京东直门医院动物实验室提供；2）JA2003千分之一电子天平：由北京东直门医院动物实验室提供；3）酶联免疫吸附法试剂盒：南京森贝伽生物科技有限公司；4）台式低速离心机：由北京东直门医院动物实验室提供。

1.5 实验方法

1.5.1 观察阴道脱落细胞 适应性喂养（1周）期间，对雌鼠连续5～10 d做阴道脱落细胞涂片观察。用小头棉签蘸取0.9%氯化钠注射液后插入大鼠阴道内0.5～1 cm，旋转1周取出分泌物后均匀涂在载玻片上，并伊红染色后直接置于显微镜下进行细胞学检查，选择动情周期为4～5 d的正常大鼠进行实验。大鼠动情周期可分为发情前期、发情期、发情后期、间情期四期，各阶段的细胞学特征，见表1。

表1 大鼠动情周期阴道脱落细胞学特征

1.5.2 分组及造模 在入选的50只大鼠中随机选取5只作为空白对照组，余45只造模。造模方法选用环磷酰胺腹腔注射 30 mg/(kg·d)，连续注射5 d[7]，以建立卵巢储备功能下降的大鼠模型。从腹腔注射结束后，每日观测阴道脱落细胞，共观察3个动情周期，动情周期紊乱（角化细胞持续出现7～8 d）提示造模成功。将造模成功的45只大鼠随机分为模型组5只，枸杞子组、月季花组、杞月茶组及芬吗通组各10只。

1.5.3 治疗方法 造模成功后，给各组大鼠每日灌胃1次，连续灌胃4周，每周停止灌胃1 d。用药用量，1）空白对照组：每日以l mL/100 g蒸馏水灌胃。2）模型组：每日以l mL/100 g蒸馏水灌胃。3）枸杞组：枸杞子颗粒剂，温水冲泡后以3.15 g/（kg·d）灌胃。4）月季花组：月季花颗粒剂，温水冲泡后以2.1 g/（kg·d）灌胃。5）杞月茶组：颗粒剂，每包含枸杞子15 g，月季花10 g，温水冲泡后以5.25 g/（kg·d）灌胃。6）芬吗通组：动情期用白色片温水冲泡后以1.26 mg/（kg·d）灌胃，动情后期和动情间期用橙色片温水冲泡后以0.21 mg/（kg·d）灌胃。

1.5.4 动物采血 治疗结束再观察5 d后，将大鼠再次称质量，采用戊巴比妥钠麻醉大鼠，选用腹主动脉采血方法取血，置于离心机中，离心力568×g，离心15 min。离心后取上清清液，置于-20 ℃冰箱中保持备用。

1.6 观察指标

1.6.1 一般情况观察 每日给药前观察大鼠精神状态、活动情况、皮毛颜色、摄食饮水、大便性状等。隔日称1次体质量，观察体质量变化，直到处死大鼠。

1.6.2 阴道上皮脱落细胞学涂片 每天早上8:00给每只大鼠进行阴道涂片，于光学显微镜下观察性周期的变化，判断动情周期，直到处死大鼠。

1.6.3 卵巢功能相关生化指标的检测 用放射免疫分析法检测大鼠血清雌二醇（E2）水平，酶联免疫吸附法检测大鼠血清基础卵泡刺激素（FSH）水平、黄体生成素（LH）水平、FSH/LH比值。

1.7 统计学方法 使用 SPSS 17.0 进行统计学分析，研究数据均采用均值±标准差（±s）表示，根据不同的要求采用不同的检验方法，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况变化比较 除空白对照组外，其余各组大鼠在造模后均出现不同程度消瘦及精神萎靡症状，毛发凌乱、粗糙缺少光泽，摄食饮水较前减少。经过治疗后的各组大鼠情况有所改善，摄食饮水较前增加，体质量较前稍有上升，精神较前好转，毛发趋于柔顺光泽等，而模型组大鼠则精神相对萎靡不振，体型消瘦，进食较少，毛发无光。各组大鼠造模前与治疗后体质量变化情况比较，见表2。

表2 各组大鼠造模前与治疗后体质量变化情况比较 g

2.2 各组大鼠动情周期变化比较 造模前各组大鼠及空白对照组大鼠动情周期为4～5 d；模型组3只大鼠动情周期延长至处死当天，2只大鼠为6～8 d；治疗组大鼠动情周期杞月茶组4～6 d，芬吗通组4～5 d，枸杞子组及月季花组均为5～8 d。

2.3 各组大鼠基础性激素水平变化比较 见表3。

表3 大鼠基础性激素水平变化比较

3 讨论

随着社会环境和生活习惯的变化，DOR发病率日益升高且趋于年轻化，若未得到积极治疗，可进一步发展为POF，严重影响着患者的生活质量。临床治疗中，西医多采用雌孕激素人工周期疗法或辅助生殖技术。激素类疗法，虽然可以使患者出现规律的月经，改善相关症状，但不能明显提高女性妊娠率，且不良反应较多。此外，在人工周期治疗期间，西药往往会抑制排卵而不能受孕，无法满足育龄期女性需求。而辅助生殖技术又费用过高，并且成功率受到卵子质量好坏限制的局限性。

中医则强调“整体观念”，注重对人体多系统、多环节的整体调节，对本病的治疗有一定优势，被越来越多的患者所接受。中医还强调“治未病”的思想，DOR可认为是POF的“未病”阶段，在“治未病”思想指导下，若积极及时有效地治疗DOR，可逆转或截断病程，防止其向POF转变。另一方面，中医中药可从根本上调理肝肾功能，可以提高机体内分泌腺体功能，增加体内性激素，调节内环境，在缓解症状的同时，保护、恢复卵巢功能，在一定程度上提高患者生育能力。

郭志强教授从事男女不孕症疾病的研究50余年，尤其关注DOR的中医治疗。郭志强教授遵循《傅青主女科·调经》 “经本于肾”“经水出诸肾”“经水非血，乃天一之水，出自肾中”“经水早断，似乎肾水衰涸”等论述，亦认为肾虚是女性经水早绝的主要病机，但同时注重“肾非肝气之相通，则肾气不能开”“女子以肝为先天”，足厥阴肝经与冲任二脉互为沟通；肝藏血，主疏泄，性喜条达，肝司血海，冲为血海。若肝气平和，则经脉流畅，血海宁静，月事正常；若妇女数伤于血，气分偏盛，七情内伤，则肝失条达，气机郁滞，从而导致冲任充盈不足或失于通利，出现月经不调。《傅青主女科》亦强调从肝论治月经病，注重肝“体阴而用阳”的生理特点和脏腑间五行制化关系，多采用疏肝解郁、平肝降逆、清肝泻火、养血柔肝、滋水涵木等调肝方法[8]。郭志强教授认为肾虚肝郁是DOR发生的主要病机，提出中药以滋肾养肝法治疗DOR，临床上疗效显著[5-6]。但在临床上，仍存在着部分患者因症状较轻，不能引起足够重视或生活节奏快、外出工作等原因未能按时服用，加之晚婚晚育带来的女性对于延长卵巢功能最佳状态的高需求，临床中需要探求更普遍化、便捷化的中医治疗方法。

本研究选用郭志强教授临床常用滋肾养肝法的君臣药——“枸杞子”“月季花”以代茶饮“杞月茶”形式进行研究。枸杞子性平味甘，归肝、肾经，具有补肾益精、养肝明目、润肺止咳之功。善于治疗肾虚腰痛、遗精滑精、月经不调、内热消渴、血虚萎黄、目暗不明、头晕目眩、阴虚劳嗽等证[9]。现代医学研究发现，枸杞子可降糖降脂、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、增强免疫力[10]，具有一定抗抑郁作用[11]、舒缓情志。研究[12]发现，枸杞多糖还可改善小鼠造血功能及肝肾功能。月季花性温，味甘，归肝经，具有活血调经，解毒消肿之功，主入肝经血分，主要用治肝郁不舒、瘀血阻滞所致月经不调。现代研究[13]发现月季花的主要活性成分为黄酮类、挥发油、鞣质、没食子酸等，其中黄酮类成分具有增强机体免疫及抗癌等活性。临床可用于治疗隐性冠状动脉性心脏病、月经不调、颈淋巴结炎、无名肿痛、月经痛、肺虚咳嗽咯血、产后阴挺等。且根据文献统计，现治疗卵巢储备功能下降的临床常用中药亦以归肝、肾经的药味为主[14]。2药相伍制成代茶饮“杞月茶”，既补肾填精养血，又柔肝疏肝、理气活血，治疗精血不足兼夹气滞血瘀之月经量少、月经后错、闭经等卵巢储备功能低下之月经不调，充分运用中医中药从根本上调理肝肾，刺激卵巢发育和卵泡生长，在缓解症状的同时提高一定的生育能力。

本实验发现，枸杞子及月季花单味药物对于DOR无明显治疗作用，但 “杞月茶”对于DOR具有明显治疗作用，且与芬吗通治疗疗效相似。此外，“杞月茶”相较于激素类药物不良反应少，可以代茶饮形式服用，具有更加便捷的优点，从而更好的治疗DOR，防微杜渐，预防POF的发生，为进一步研发改善卵巢功能的保健品奠定一定基础。