庐江汤池温泉中首个嗜热菌的分离鉴定及特性研究

张凤琴

（巢湖学院化学与材料工程学院，安徽巢湖238000）

嗜热菌是一类最适宜生长温度高于50°C，最低生长温度不低于30°C，最高生长温度在60°C以上的极端环境微生物[1-2]。对嗜热菌的研究，国外起步较早，在美国、冰岛、俄罗斯及新西兰等地均有大量嗜热菌的分类种群被发现[3-5]。近几年来，国内在嗜热菌研究领域也有不少收获，在云南、广州、四川、福建、台湾和江西等地的多处温泉中有一些嗜热菌被分离鉴定[6-8]。嗜热菌因其超强的耐热性和独特的生理生化特性，在生物科学研究及工业生产领域都有着独特的作用[9]，嗜热菌产生的嗜热酶及其菌体均具有很广阔的应用前景。嗜热菌的嗜热酶在高温下具有很强的稳定性，可用于需要高温催化的食品、医药工业、环境保护、能源等领域，如嗜热脂肪芽孢杆菌产生的高温α-淀粉酶可使淀粉完全转化为右旋葡萄糖，嗜热酶可生产新型药物，嗜热酶可降解芳香族化合物、氰化物、有机磷农药等难降解物质，嗜热菌产生的纤维素酶在乙醇发酵中，可提高乙醇产量。嗜热菌菌体可直接用于工业中，如硫化细菌可用于硫化矿的生物沥滤和煤炭的脱硫过程[10]。

庐江汤池地热资源丰富，嗜热菌研究潜力大，但目前仍未见对庐江地区嗜热菌的研究报道。本研究从庐江汤池温泉水（约60 ℃，pH 7.0）中分离嗜热菌，对分离得到的嗜热菌进行分子生物学鉴定、形态学特征和生理生化特性研究，为其在以后的科学研究及工业应用提供理论支持和物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

样品采集于庐江汤池温泉，东经117°01′、北纬31°33′。细菌DNA 提取试剂盒和PCR 胶回收试剂盒，购自大连TaKaRa公司；引物合成和测序由上海生工生物工程有限公司完成。牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化钠5.0 g/L，调节pH 至7.2～7.4（固体培养基添加琼脂14.0 g/L）。牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂等药品均为国产生物级。

1.2 方法

（1）嗜热菌分离纯化

取（0.2～0.3）mL温泉水，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，60°C下恒温培养24 h。经过反复多次纯化直至得到单菌落。

（2）菌株的分子生物学鉴定

菌株基因组DNA 的提取参照细菌DNA 试剂盒（大连TaKaRa 公司）操作。采用细菌通用引物扩增16S rRNA 基因序列并对产物进行测序（上海生工生物工程有限公司）。将测序结果与GenBank中已报道的序列进行比对，并用MEGA6的Neighbor joining法构建系统发育树，判定菌株的系统分类地位。

（3）菌株的形态观察

将纯化菌株用平板划线法接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，60°C恒温培养24 h。观察菌落生长情况、形态、大小、表面、边缘及颜色等各方面特征。挑取单菌落，对其进行革兰氏染色，通过光学显微镜观察菌体形态和革兰氏分析。

（4）生理生化特性研究

生化特性鉴定。通过非发酵细菌生化鉴定管对菌株的生化特性进行鉴定。该试验选用的非发酵细菌生化鉴定管共包含14 个生化鉴定项目：精氨酸（Arginine）、鸟氨酸（Ornithine）、赖氨酸（Lysine）、氨基酸对照（Amino acid control）、枸橼酸盐（Citrate）、硝酸盐还原作用（Nitrate reduction）、尿素（Urea）、七叶苷（Esculin）、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）、蔗糖（Sucrose）、麦芽糖（Maltose）、木糖（Xylose）、葡萄糖（Glucose）、硫化氢（Hydrogen sulfide）和氧化酶（Oxidase）。

不同pH下的生长情况。将菌液接种于pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的牛肉膏蛋白胨液体培养基中。于60°C、160 r/min条件下培养24 h。通过分光光度计测定菌体浓度，从而确定菌株生长的pH 范围及最适宜pH。

最高耐受温度的确定。取（0.2～0.3）mL菌液，涂布到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，分别于60、65、70、75、80°C生长24 h，观察菌株生长情况，初步确定菌株最高耐受温度范围。确定范围后，再在范围内以1°C为间隔，确定菌株具体的最高耐受温度。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与纯化

从汤池温泉水中分离纯化得到一株嗜热菌，命名为LJTC-1（NCBI登录号：KT454966）。

2.2 菌株的分子生物学鉴定

通过PCR扩增得到菌株LJTC-1的16S rRNA基因片段，将扩增产物测序后与GenBank中已报道的序列进行比对，并将序列上传至GenBank（接受号：KT454966）。通过构建系统发育树（图1）与进化关系比较亲近的属种进行系统发育学分析，得知菌株LJTC-1属于Thermoactinomyces属，且与Thermoactinomycessp.60X-8(JN578486.1)亲缘关系最亲近，二者在同一个进化分支上。

图1 LJTC-1菌的系统发育进化树

2.3 菌株的形态特征

LJTC-1菌落形态为白色、不透明、圆形、边缘不规则、表面隆起、干燥、似毛状、直径在（3.0～5.0）mm，如图2（a）所示。菌体经革兰氏染色后镜检，LJTC-1菌呈链珠状，革兰氏阳性菌，如图2（b）所示。

图2 菌株LJTC-1的菌落形态和革兰氏染色镜检图片

2.4 生理生化特征

（1）生理生化特性鉴定

菌株LJTC-1 在精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、氨基酸对照、枸橼酸盐、尿素、OPNG 及氧化酶试验中呈阳性；在硝酸盐还原反应、七叶苷、硫化氢试验中呈阴性（见表1）。

表1 生理生化特征

（2）最适宜pH

初步测定菌株LJTC-1可生长的pH范围为5.5～9.0，最适宜pH约为7.5，如表2和图3所示。

表2 不同pH下菌株生长情况

图3 pH对菌株的影响

（3）最高耐受温度

通过初步实验确定菌株LJTC-1在（60～70）°C可生长，在75 ℃以下无法生长，如表3所示。由表3可确定该菌株最高耐受温度范围为（70～75）℃，为了进一步确定耐受温度，将该菌株放于71、72、73和74 ℃下培养，培养结果如表4所示。在74 ℃时菌株仍能生长，而75 ℃不生长，故确定其最高耐受温度为74 ℃。

表3 不同温度下菌株生长情况（Ⅰ）

表4 不同温度下菌株生长情况（Ⅱ）

3 讨 论

从研究结果可知，菌株LJTC-1 与Thermoactinomycessp.60X-8（JN578486.1）亲缘关系最亲近，Thermoactinomycessp.60X-8（JN578486.1）菌在（15～40）℃范围内可生长[11]，而该菌最高耐受温度为74 °C。由此推测庐江汤池地区独特的地理条件和温泉环境可能对造成菌株LJTC-1与亲缘关系相近菌株间差异起到一定作用。

目前，分离得到的嗜热菌最高耐受温度多为（65～72）℃[12-14]，但Balwinder SS从垃圾堆放处筛选得到能耐受90 ℃高温的嗜热菌Geobacillus[4]，这可能与采样点的高温环境有关。嗜热菌对高温具有独特的适应机制，主要与细胞膜、蛋白质与遗传物质有关。嗜热菌的膜脂具有长链和高饱和度的脂肪酸，能形成很强的疏水键，从而使细胞膜在高温环境下保持正常的生理功能[15-16]；嗜热菌蛋白质稳定的天然结构和细胞内的促进热稳定因素，即嗜热菌蛋白质的热稳定性是其耐热性的主要机制[17]；此外，嗜热菌DNA结构中G+C%含量较高且螺距较短，有利于DNA的稳定，嗜热菌tRNA周转速度快且其G+C%含量高，因此其tRNA在高温下的稳定性较好，故嗜热菌的耐热性与其遗传物质的稳定性有关[18-19]。

安徽庐江汤池地区地热资源丰富，开发潜力大。但目前仍未有关于庐江汤池地区的嗜热菌研究，此研究是第一篇关于庐江汤池温泉中嗜热菌的文章，所分离鉴定的菌株LJTC-1是目前唯一一株从庐江汤池温泉中分离得到的嗜热菌。该研究结果可以为当地政府对庐江汤池温泉资源保护和开发利用提供理论支持，并为其在以后的科学研究及工业应用方面提供参考。后续将对该菌的高温酶进行特性研究并对其结构进行分析，找出其与亲缘关系相近菌株高温酶之间的差异，并对嗜热菌和其高温酶的应用进行研究，通过分子生物学手段将嗜热酶在性状更优良的微生物中进行克隆表达[20]。