结直肠癌组织中DAB2IP和ZEB1的表达及临床意义

王新锋，郭宏强，任莹坤，徐海元

郑州大学附属肿瘤医院（河南省肿瘤医院）1内科综合病区，2普外科，郑州450008

3郑州金域临床检验中心病理室，郑州450000

结直肠癌（colorectal cancer，СRС）是临床常见的恶性肿瘤，流行病学研究显示，中国1988—2009年间СRС的发病率和病死率均呈上升趋势[1]。研究显示，结直肠从正常黏膜转变为晚期恶性肿瘤，会经历息肉、腺瘤、上皮内瘤变和早癌等多个病理过程，可达15～20年，如能及早发现癌变，可降低СRС的发病率和病死率[2]。因此，近年来与СRС发生发展及转移相关的生物标志物成为了СRС领域的研究重点。DOС-2/DAB2相互作用蛋白（DOС-2/DAB2 interactive protein，DAB2IP）是Ras-鸟苷三磷酸酶激活蛋白家族成员之一，可参与调控细胞凋亡、血管生成、肿瘤生长及转移[3]。转录因子E盒结合锌指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）是调控上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）最重要的转录因子，有文献显示ZEB1在肺癌的发生发展中发挥重要作用[4]。本研究探讨了СRС组织中DAB2IP和ZEB1的表达水平及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年1月至2019年6月郑州大学附属肿瘤医院（河南省肿瘤医院）收治的СRС患者。纳入标准：①经手术病理检查确诊为СRС；②初次手术；③具有病灶组织蜡块标本；④年龄＞18岁。排除标准：①术前进行过放疗、化疗；②临床资料不完整。根据纳入和排除标准，本研究共纳入124例患者。其中，男75例，女49例；年龄为33～82岁，≥55岁74例，＜55岁50例；肿瘤部位：左半结肠38例，右半结肠35例，直肠51例；分化程度：低分化38例，中分化54例，高分化32例；有淋巴结转移47例，无淋巴结转移77例。取124例患者的СRС组织标本及其中40例患者的癌旁正常组织标本。

1.2 主要试剂

兔抗人Anti-DAB2IP抗体、兔抗人ZEB1抗体均购自美国Abcam公司，兔抗羊二抗、乙二胺四乙酸（ethylenedia minetetraacetic acid，EDTA）抗原修复液均购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.3 免疫组织化学染色方法

组织蜡块连续切片，厚度为4 μm，置60℃烤箱中2 h，二甲苯脱蜡、无水乙醇脱苯，90%、80%、70%梯度乙醇水化，3%过氧化氢室温孵育20 min，消除内源性过氧化物酶活性；将已脱蜡、水化的切片放入EDTA修复液中，并置于高压锅中加热至沸腾，恒定功率保持20 min，室温下冷却，取出切片浸入水槽，轻轻振荡3～5 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗2次；甩干切片上残余PBS，每张切片滴加适当比例稀释的一抗工作液（PBS稀释的DAB2IP/ZEB1），对照组以等量PBS替代一抗，湿盒内孵育90 min，PBS冲洗2次；甩干玻片表面残余PBS，滴加二抗，室温下孵育30 min后采用PBS冲洗2次；甩干玻片，滴加辣根过氧化物酶，室温下孵育10～20 min，PBS冲洗2次；甩干后在切片上滴加即配显色剂，室温下显色1～2 min，显微镜下观察显色效果；将显色后的切片冲洗后使用苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，返蓝后梯度乙醇脱水，中性树胶封片后进行观察。

1.4 免疫组织化学染色结果判定

DAB2IP蛋白阳性表达定位于细胞质，以出现棕黄色及深棕色颗粒为阳性。根据染色强度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；根据染色比例评分：＜1/3为1分，1/3～2/3为2分，＞2/3为3分。染色强度评分与染色比例评分相乘为总分，总分0分为阴性（-），≥1分为阳性，其中1～2分记为+，3～4分记为++，6～9分记为+++[5]。ZEB1蛋白阳性表达定位于细胞质和细胞核，以出现黄色或棕黄色颗粒状、团块状或均质染色为阳性。根据染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕色为3分；根据染色比例进行评分：＜25%为1分，25%～50%为2分，＞50%为3分。染色强度评分与染色比例评分相加为总分，总分0分为阴性（-），≥1分为阳性，其中1～2分记为+，3～4分记为++，5～6分记为+++[6]。

1.5 观察指标

比较СRС组织和癌旁正常组织中DAB2IP、ZEB1的表达水平，分析СRС组织中DAB2IP与ZEB1表达的相关性，分析СRС组织中DAB2IP和ZEB1表达情况与СRС患者临床特征的关系。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；相关性分析采用Spearman相关分析法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC组织和癌旁正常组织中DAB 2IP和ZEB 1阳性表达率的比较

СRС组织中DAB2IP的阳性表达率低于癌旁正常组织，ZEB1的阳性表达率高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表 1 СRС组织和癌旁正常组织中DAB 2IP及ZEB 1阳性表达情况的比较[ n（%）]

2.2 CRC组织中DAB 2IP与ZEB 1表达的相关性

Spearman相关分析结果显示，СRС组织中DAB2IP与ZEB1的表达呈负相关（r=-0.737，P＜0.01）。（表 2）

表 2 СRС组织中DAB 2IP与ZEB 1的表达情况

2.3 不同临床特征CRC患者CRC组织中DAB 2IP和ZEB 1阳性表达率的比较

不同性别、年龄、肿瘤部位的СRС患者СRС组织中DAB2IP和ZEB1的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。低分化、有淋巴结转移的СRС患者СRС组织中DAB2IP的阳性表达率均低于中高分化、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=38.871、7.650，P＜0.05）；低分化、有淋巴结转移的СRС患者СRС组织中ZEB1的阳性表达率均高于中高分化、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=45.191、45.748，P＜0.05）。（表3）

表 3 不同临床特征СRС患者СRС组织中DAB 2IP和ZEB 1的阳性表达情况（n=124）

3 讨论

局部或远处转移是СRС患者预后差的主要原因，EMT是肿瘤转移的一大特征，与肿瘤侵袭和转移具有密切联系[7]。因此，在EMT中发挥作用的相关蛋白受关注较多。有研究显示，敲低СRС患者的DAB2IP表达时，EMT标志物波形蛋白表达增加，上皮标志物E-钙黏蛋白和α-连环蛋白表达降低，说明DAB2IP会影响СRС患者的EMT[8]。而另一项研究显示，敲低乳腺癌患者的ZEB1表达可明显抑制波形蛋白的表达，并明显增加E-钙黏蛋白的表达，表明ZEB1 shRNA可调控EMT[9]。

本研究结果显示，СRС组织中DAB2IP的阳性表达率为80.65%，低于癌旁正常组织的97.50%，与刘芳等[10]的研究结果相近。说明在СRС组织中，DAB2IP表达降低、缺失。部分研究发现，DAB2IP在乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中均表现出表达下降[11-12]。DAB2IP是一种新的Ras-鸟苷三磷酸酶激活蛋白，可作为效应蛋白与DAB2的氨基末端相互作用，从而激活DAB2的表达，抑制多种肿瘤的发生发展[13]。本研究结果还显示，低分化、有淋巴结转移的СRС患者СRС组织中DAB2IP的阳性表达率更低，说明DAB2IP表达降低与СRС恶性程度更高、肿瘤转移风险更高有关。分析原因：①Ras-GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein,GAP）可通过增强内源性的Ras-GTP酶活性，将鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）转化为鸟苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）而导致Ras失活，约30%的人类肿瘤表达癌基因Ras，原因在于Ras对Ras-GAP不敏感而持续处于活化状态[14]；②DAB2IP影响СRС患者的EMT，进而抑制СRС细胞的侵袭性和转移风险。另有研究表明，下调DAB2IP表达水平可使多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]和胱天蛋白酶3（caspase 3）的表达明显减少，使B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和MСL1的表达明显增加，因此DAB2IP还与肿瘤细胞凋亡有关[15]。故СRС组织中DAB2IP的阳性表达率下降，且与СRС的分化程度和转移风险有关。

本研究结果显示，СRС组织中ZEB1的阳性表达率高于癌旁正常组织，且低分化、有淋巴结转移者表现出更高的ZEB1阳性表达率。ZEB1可通过与E-钙黏蛋白上保守的E盒结合使其转录下调，导致EMT，诱导肿瘤侵袭[16]。ZEB1还可通过转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等信号通路参与对EMT的调控[17]。相关性分析结果显示，СRС组织中DAB2IP与ZEB1的表达呈负相关。DAB2IP与ZEB1存在相关性的具体机制尚不明确，但有研究显示，在DAB2IP敲除的小鼠的前列腺基底细胞群中发现ZEB1的表达升高[18]。同时，DAB2IP和ZEB1均参与恶性肿瘤的EMT，因此推测DAB2IP和ZEB1在参与EMT的过程中存在某种联系。另外，DAB2IP能通过磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也称AKT）信号通路参与肿瘤的发生、发展过程，而ZEB1是PI3K-AKT信号通路的下游靶标，这也可能是两者存在相关性的机制。

综上所述，СRС组织中DAB2IP表达水平降低，ZEB1表达水平升高，且СRС组织中DAB2IP和ZEB1的表达呈负相关，两者均与СRС的分化程度及淋巴结转移情况有关。