营养成分对‘安陆1号’银杏胚离体培养成苗的影响

胡燕梅，张 力，郭云贵，方中明，3

(1.江汉大学 期刊社，武汉 430056；2.武汉生物工程学院 生命科学与技术学院，武汉 430415；3.贵州大学 农学院，贵阳 550025)

银杏(GinkgobilobaL.)属裸子植物，是原产我国的古老孑遗植物，也是集药用、食用、园林绿化、观赏、材用、生态防护、科研及文化于一体的多功能树种.近年来，随着银杏的不断开发利用，特别是果用林和叶用林产业的不断发展，对银杏苗木的需求也大大增加[1].但其传统的播种育苗方法繁殖率低、周期长，不能满足市场需求，而采取更高效快速的组织培养法对银杏胚进行离体培养使之快速成苗是有效可行的方法.但银杏胚存在生理后熟，给银杏的离体培养带来困难[2-3].近年来我国学者对银杏胚离体培养成苗虽开展了多项研究，但由于取材过程中存在品种不明确的问题，导致银杏胚离体培养萌发成苗效果的差异较大[4-8].银杏在世界的分布范围十分广泛，但由于选育目的不同和国际间交流较少等原因，目前银杏品种命名和分类比较混乱.2011年南京林业大学曹福亮教授[9]提出将银杏品种的分类体系根据培养目的不同分为核用、叶用、花粉用、观赏用、材用五大类.本文针对湖北本土的银杏品种，即核用品种中的中子品种系的‘安陆1号’开展了6种基本培养基及4种外源添加物对胚离体萌发成苗的试验，以期探索该品种银杏胚离体萌发成苗的适宜因子，为银杏种苗快速生产和种质离体资源的保存提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与处理

当年生新鲜银杏种子来源于湖北省随州地区，根据文献[9]初步鉴定，该批银杏种子为中子品系中的‘安陆1号’.银杏种子去外种皮后阴干，剥去骨质中种皮，在超净工作台上用75%的酒精浸泡30 s后用0.1%升汞消毒8 min，无菌水冲洗5遍，于无菌条件下切开胚乳仔细取出胚，接种在下述各种培养基中.每个处理接种20个胚，重复3次，于恒温(25±2)℃下培养，光照强度1 500～2 000 Lux,光照时间为10 h/d.

1.2 试验设计及方法

1.2.1 基本培养基对银杏胚萌发成苗的影响 基本培养基分别为MS、B5、N6、SH、MK、6,7-V.每种培养基分别加入30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，pH=5.8±0.2.

1.2.2 椰子乳对银杏胚萌发成苗的影响 选取新鲜的椰子，倒出汁液煮沸后滤纸过滤得到滤液，以N6+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂为基本培养基(pH=5.8±0.2)，每升培养基分别加入50、100、150、200 mL椰子乳，以不加椰子乳为对照(CK).

1.2.3 活性炭对银杏胚萌发成苗的影响 每升N6+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂基本培养基(pH=5.8±0.2)分别加入1、2、3、4 g活性炭,以不加活性炭为对照(CK).灭菌后待琼脂快凝固时摇动培养基使活性炭均匀悬浮,凝固后4℃冰箱保存备用.

1.2.4 水解酪蛋白对银杏幼胚萌发成苗的影响 每升N6+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂基本培养基(pH=5.8±0.2)分别加入0.2、0.5、1.0、2.0 g水解酪蛋白,以不加水解酪蛋白为对照(CK).

1.2.5 银杏胚乳汁对银杏幼胚萌发成苗的影响 选取新鲜的银杏胚乳，用榨汁机破碎后四层纱布过滤得到胚乳汁液，每升N6+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂基本培养基(pH=5.8±0.2)分别加入5、10、50、100、150、200 mL，以不加胚乳汁为对照(CK).

1.3 试验结果统计

培养28 d后测量株高；统计有效接种数、萌发数和成苗数，计算萌发率和成苗率；数据记录的同时对银杏胚的成苗过程进行拍照.

株高：直尺测量幼苗整体高度(cm)；有效接种数(Ne)：培养28 d后未污染的接种数；萌发数(Mn)：子叶展开，胚根长出，胚芽露出的幼胚数；成苗数(Cn)：胚根长出，胚芽长高，抽出真叶的幼胚数.萌发率(M)和成苗率(C)用以下公式计算.

M=(Mn/Ne)×100%；C=(Cn/Ne)×100%.

采用Excel 2010对数据进行处理，采用SPSS 18.0软件中完全随机单因素试验方差分析邓肯氏新复极差法(Duncan’s multiple range test)评估各试验处理间差异显著性.

表1 基本培养基对银杏胚萌发成苗的影响Tab.1 Effect of basic medium on ginkgo embryos of plantlet in vitro

注：同列数据标有不同字母表示差异显著(P<0.05).下同.

2 结果与分析

2.1 基本培养基对银杏胚萌发成苗的影响

银杏胚接种培养3～5 d后其子叶均展开，持续培养发现子叶慢慢由淡黄色转绿.5～7 d后观察到胚芽与胚根有抽出迹象，同时有部分胚子叶发生卷曲、膨大，有愈伤化迹象.14 d后继续观察，有萌发迹象的幼胚的胚根逐渐长出，胚芽微露.28 d后部分幼苗胚芽抽出真叶，胚根继续长深长粗，基本成苗(见图1).统计萌发率、成苗率和株高见表1.

图1 银杏胚萌发成苗过程

Fig.1 Germination and seedling formation ofGinkgobilobaembryo in vitro

试验结果显示基本培养基N6中胚萌发率达到85.7%，在同组试验中显著性最高，其中36.7%萌发苗的胚芽抽出真叶，成为成型的幼苗.而其他5种基本培养基中胚均仅萌发而不能成苗，表明N6为本试验中‘安陆1号’银杏胚萌发和成苗的最适基本培养基.

表2 椰子乳对银杏胚萌发成苗的影响Tab.2 Effect of coconut milk on ginkgo embryos of plantlet in vitro

表3 活性炭对胚萌发成苗的影响Tab.3 Effect of activated carbon on ginkgo embryos of plantlet in vitro

表4 水解酪蛋白对银杏胚萌发成苗的影响Tab.4 Effect of casein hydrolysate on ginkgo embryos of plantlet in vitro

表5 银杏胚乳汁幼胚萌发成苗的影响Tab.5 Effect of embryo milk on ginkgo embryos of seedlings in vitro

2.2 椰子乳对银杏胚萌发成苗的影响

由表2可知，基本培养基N6中加入椰子乳后，萌发率整体不如CK，但椰子乳低体积分数时成苗率有所增加.同时幼苗株高整体较对照组要好，株高最高可达到3.5 cm.即椰子乳加入培养基中虽不能提高萌发率，但加入量适当时可提高成苗率，且能促进幼苗长势，尤其以100 ml/L的椰子乳处理最好.但考虑到工厂化育苗批量生产的经济成本及试验工序的繁琐性，认为椰子乳在‘安陆1号’银杏胚离体成苗试验中可以不予添加.

2.3 活性炭对银杏胚萌发成苗的影响

由表3可知基本培养基中加入适量的活性炭可显著性促进银杏胚的萌发和成苗，尤其以2 g/L的活性炭处理成苗效果最好，且幼苗株高达到3.7 cm，均与对照有显著性区别，但该处理组幼苗较细长且瘦弱，长势不如对照.表明活性炭加入培养基中虽可吸附一定的有害物，促进幼胚萌发，但同时可能又吸附了培养基中胚生长发育的某种物质，导致幼苗长势较差.从幼苗长势来看，建议‘安陆1号’银杏胚离体成苗试验中可以不予添加活性炭.

2.4 水解酪蛋白对银杏胚萌发成苗的影响

由表4可知水解酪蛋白的4个处理较对照组的萌发率、成苗率和平均株高3个指标均有显著性促进作用，但随着其加入量的上升，胚萌发率和成苗率呈先升后降的趋势.其中0.5 g/L和1.0 g/L处理组萌发率达到100%，1.0 g/L处理成苗率也达到100%，而0.5 g/L处理幼苗成苗率也达到92.8%，且其幼苗长势却明显优于1.0 g/L处理，其幼苗长势最粗壮.综合考虑认为0.5 g/L的水解酪蛋白加入培养基中最适合‘安陆1号’银杏胚萌发成苗，也建议后期生产中考虑加入水解酪蛋白.

2.5 胚乳汁对银杏胚萌发成苗的影响

由表5可知当银杏胚乳汁达到100 mL/L时萌发率快速降低，且成苗率为0，表明胚乳汁加入量过高时不利于胚成苗.但适当低加入量的胚乳汁却可以显著促进胚的萌发和成苗，尤其是当胚乳汁为10 mL/L时萌发率及成苗率均较理想，且幼苗长势粗壮，有利于‘安陆1号’银杏胚的成苗.考虑到银杏胚乳的价格及取材的复杂性，建议工业化批量生产中不宜添加，但在优质种苗的保存与培育过程中可适量加入.

3 结论与讨论

‘安陆1号’为湖北省随州地区银杏中子品系中的典型代表品种，本试验以此为研究对象，探讨了基本培养基及几种添加物对该品种胚离体萌发成苗的影响.试验结果表明：6种基本培养基中N6最适于银杏胚的萌发及成苗，4种添加物在适宜添加量下均能有效促进胚的萌发及成苗，其中100 mL/L椰子乳促进银杏胚萌发率和成苗率分别提高到66.7%和40.1%，2 g/L活性炭促进银杏胚萌发率和成苗率分别提高到86.7%和46.2%，0.5 g/L水解酪蛋白处理可提高到100%和92.8%,10 mL/L银杏胚乳汁促进银杏胚萌发率和成苗率分别提高到92.8%和71.4%.但由于实际种苗生产过程中规模较大，考虑到培养基配制工艺的繁琐及生产成本增加，且综合考虑几种添加物的实际促进效果，建议银杏离体培养过程中以添加水解酪蛋白为主.

普遍认为银杏胚的生理后熟给银杏的离体培养带来困难.Holt[10]认为银杏种子从母体脱离后即有发育完好的胚，外层的浆种皮是银杏种子冬季休眠的原因，其存在显著降低了整体萌发率.陈颖等[11]研究表明银杏的种胚存在生理后熟现象，大子叶胚(3.0～5.0 mm)和小子叶胚(1.0～3.0 mm)接种在不同的培养基上后发现大子叶胚愈伤化程度小，而小子叶胚全部愈伤化，继续培养出现芽点.郭长禄等[7]研究报道大于3 mm的胚更容易成功诱导出胚状体从而得到组培苗.在本试验的前期探索性预试验中发现若胚在1 mm左右则无法形成愈伤组织或苗，直接枯死；胚在2 mm左右则易于形成愈伤组织，不易成苗；3 mm左右的胚则易于成苗.

N6培养基是1974年我国学者朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计[12],但本试验结果得出N6也适合裸子科植物银杏胚的培养，是否意味着单子叶植物和裸子植物之间对营养的需求有相似之处，进而在亲缘关系上是否更近一层，值得深入研究.罗言云等[6]表明6,7-V培养基适宜银杏幼胚萌发，其胚成苗率达到100%，这可能与银杏种子来源不一致有关；同时认为添加0.1 mg/L的NAA有助于苗的生长，但在本试验的前期探索中，6种基本培养基中加入0.1 mg/L NAA时成苗率均极低，且容易产生大量的愈伤组织而抑制了幼苗的萌发.陈颖等[13]认为其供试的5个银杏品种在DCR培养基中均有较高的萌发率，且幼苗长势较好，在本试验中没有使用此培养基，但一致都认为B5不适宜银杏幼胚的生长.单超[14]研究结果表明银杏成熟胚诱导在MS基本培养基的萌发率为41.38%，高于本试验的MS培养基效果，但远低于本试验的N6培养基.

水解酪蛋白是多种氨基酸的混合物，对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用，也有相关试验证明水解酪蛋白对其他植物的离体培养有较好的促进作用[15-16].本试验的4种添加剂中水解酪蛋白的效果最好，对银杏胚的成苗有显著促进作用，胚的生长速度明显加快，当其添加量在1 g/L时幼胚萌发率与成苗率均较高，与罗言云的试验结果相同[6]，但本试验中0.5 g/L水解酪蛋白处理组的银杏幼苗长势却更好.已有试验证明椰子乳可以很大程度上促进银杏幼胚的成苗[4]，郭长禄等[7]也证明在MK培养基中加入100 mL/L椰子乳时对胚状体的生长发育有很好的促进作用，胚状体的成苗率达到34.5%.胡燕梅等[17]报道100 mL/L椰乳能促进银杏子叶愈伤组织生物量的提高.本实验向N6培养基中加入同样量的椰子乳，其成苗率达到了40.1%，说明椰子乳可以促进银杏组织培养过程中的多种无性系材料的生长发育.赵海红等[18]试验结果表明活性炭的加入可显著促进马铃薯脱毒试管苗的根茎叶的发育与生长，但活性炭的存在也导致试管苗植株的生长势较弱，与本文结果相似.

冯景等[19]探讨了自然界中银杏种子发育的全过程中胚乳内含物质可溶性糖、淀粉、蛋白质等的动态变化规律，结果表明在后期胚发育中胚乳内含物淀粉处于不断累积和被利用，即胚乳参与了胚胎发育的代谢过程，为胚的成熟提供了营养物质.方诗雯[20]也报道胚乳内含物参与了银杏种子的后熟过程.胡燕梅等[17]报道在离体培养中银杏胚乳汁能促进银杏子叶愈伤组织生物量的提高.姜蓓等[21]报道在添加3%胚乳汁的WPM培养基条件下，无菌苗的发芽率及生根率都保持在90%以上.本试验报道的10 mL/L的胚乳汁加入N6培养基中，萌发率及成苗率均显著高于对照，但成苗率仅为71.4%，有可能是基本培养基或品种不同所致.