开菲尔发酵复合果蔬固体饮品的制备及体外功能研究

陈树俊 - 罗 佳

(山西大学生命科学学院，山西 太原 030006)

开菲尔属于益生菌发酵乳，发酵菌种为开菲尔粒或开菲尔菌，开菲尔菌由乳酸菌和酵母菌的某些属种组成[1]。何雪畅等[2]研究发现，开菲尔制品具有缓解乳糖不耐症、抑制病原菌、改善消化机能、刺激免疫系统和降低胆固醇水平等功效。

近年来，营养丰富、风味独特的复合果蔬制品已成为人们青睐的健康食品。目前市场上的发酵果蔬产品发酵菌种单一、果蔬原料单调[3]；有关开菲尔菌的研究多为乳制品[4]，例如，陈培康[5]曾将从开菲尔粒中分离的克鲁维酵母与植物乳杆菌接入马铃薯、牛奶中进行发酵，制得酒味协调、香气宜人且口感清爽的开菲尔马铃薯发酵乳酒。目前未见有研究者将Kefir接入非乳制品中进行发酵。试验拟以开菲尔发酵剂发酵苹果浆—番茄酱—沙棘原汁复合果蔬，再添加一定量的菊粉、低聚果糖和麦绿素，并经真空冷冻干燥制作一种营养丰富、功能独特的新型开菲尔产品。旨在探索复合果蔬发酵工艺，以及对添加菊粉、低聚果糖和麦绿素再经冻干后的固体饮品进行体外降糖、降脂和抗氧化功能评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果浆、番茄酱：青岛福得味食品有限公司；

沙棘原汁：山西野山坡食品有限公司；

开菲尔发酵剂(乳酸菌∶酵母菌数量比约为3∶1)：山西大学生命科学学院；

氢氧化钠：分析纯，天津市大陆化学试剂厂；

乳酸细菌培养基(MRS)、酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)、琼脂、α-淀粉酶(3 700 U/g)、牛胆酸钠、胰蛋白酶(250 U/mg)：北京索莱宝科技有限公司；

DPPH：美国Sigma公司；

试验试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子台秤：ACS-15型，长治市青鸾衡器有限公司；

隔热式电热恒温培养箱：PYX-DHS-50X65-S-Ⅱ型，上海跃进医疗器械厂；

真空冷冻干燥成套设备：TFDS25型，烟台中孚冷链设备有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-5100型，上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

Kefir发酵剂→活化→果蔬复配→调节pH→杀菌→冷却→接种→保温发酵→调配→预冻→冻干→产品

(1) 果蔬复配：通过预试验确定苹果浆∶番茄酱∶沙棘原汁按质量比15.0∶4.0∶3.5进行复配，并搅拌均匀。

(2) 调节pH：用小苏打水调节果蔬浆pH至4.7，封口。

(3) 杀菌：90 ℃恒温杀菌20 min。

(4) 开菲尔发酵剂活化：将开菲尔发酵剂加入到15倍体积的新鲜灭菌乳中，于30 ℃恒温培养24 h。吸取初次培养液加入到新鲜灭菌乳，重复培养，至乳酸菌活菌总数浓度约为107～108CFU/mL，作为母发酵剂备用。

(5) 接种：杀菌复合果蔬中接种8%的Kefir母发酵剂。

(6) 保温发酵：发酵温度31 ℃。

(7) 调配：将发酵及未发酵复合果蔬的质量折算为冻干后干物质质量，向其中添加菊粉、低聚果糖和麦绿素，添加量分别为复合果蔬折算质量的13%，5%，3%[6-8]，搅拌均匀。

(8) 预冻、真空冷冻干燥：将物料倒入模具中，于-43 ℃预冻8 h后脱模、冻干。设定冷阱温度-45 ℃、干燥仓内真空度10 Pa。

1.3.2 单因素试验 以发酵时间、菌种接种量和发酵温度为试验因素，乳酸菌和酵母菌活菌数为考察指标，设计开菲尔菌发酵复合果蔬单因素试验。

(1) 发酵时间的影响：固定开菲尔菌接种量8%，发酵温度31 ℃，发酵时间分别为38，42，46，50，54 h，以确定最佳发酵时间。

(2) 菌种接种量的影响：固定发酵时间46 h，发酵温度31 ℃，开菲尔菌接种量分别为4%，6%，8%，10%，12%，以确定最佳接种量。

(3) 发酵温度的影响：固定发酵时间46 h，开菲尔菌接种量8%，发酵温度25，28，31，34，37 ℃，以确定最佳发酵温度。

1.3.3 响应面优化 根据单因素试验结果，以发酵时间、开菲尔菌接种量和发酵温度为考察因素，乳酸菌活菌数和酵母菌活菌数为响应值，使用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken组合设计原理设计三因素三水平的响应面试验[9]。

1.3.4 活菌数的测定 参照文献[10]。

1.3.5 体外降糖试验 果蔬复配后未经Kefir发酵，添加菊粉、低聚果糖、麦绿素再经真空冷冻干燥制成的产品即为未发酵固体饮品，以未发酵固体饮品为对照。将发酵及未发酵固体饮品制成不同浓度梯度稀释液，参照冯雁波等[11]的方法测其α-淀粉酶抑制率。反应液3 000 r/min离心20 min后取上清液稀释1 000倍，采用苯酚硫酸法[12]测定葡萄糖含量。葡萄糖回归方程：y=0.139x-0.103 9，R2=0.990 2。

1.3.6 体外降脂试验 将发酵及未发酵固体饮品制成不同浓度梯度稀释液，参照包怡红等[13]的方法测其胆酸钠结合量。牛黄胆酸钠的回归方程为：y=0.09x-0.139 8，R2=0.969 9。

1.3.7 抗氧化活性测定

(1) DPPH自由基(DPPH·)和羟基自由基(·OH)清除率的测定：参照文献[14]。

(2) 铁还原力的测定：参照文献[15]。

1.4 数据分析与处理

采用Microsoft Excel软件进行数据处理，用Origin 9.1软件作图，响应面试验设计与分析采用Design-Expert 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

如图1所示，最佳发酵时间为46 h，最佳菌种接种量为8%，最佳发酵温度为31 ℃。

2.2 发酵条件响应面优化

2.2.1 因素水平和编码设计 根据单因素试验结果确定的因素水平表见表1。

2.2.2 响应面试验设计与结果 Box-Behnken试验设计及结果如表2所示。

图1 各因素对发酵过程中活菌数的影响Figure 1 Effect of factors on viable bacteria during fermentation

表1 响应面试验因素及水平

Table 1 Factors and levels of independent variables used for response surface analysis

水平A发酵时间/hB菌种接种量/%C发酵温度/℃-1426280468311501034

2.2.3 回归方程及参数分析 由软件可得各因素对样品乳酸菌活菌数(Y1)和酵母菌活菌数(Y2)的二次回归方程分别为：

(1)

(2)

由表3可知，两模型极显著(P<0.01)，失拟项不显著，相关系数R2分别为0.998 5和0.999 2，说明模型拟合性较好，试验误差小，模型成立。3个因素对乳酸菌活菌数影响的主次顺序为C>A>B，对酵母菌活菌数影响的主次顺序为A>C>B；A2、B2、C2对乳酸菌活菌数有极显著影响(P<0.01)，A和C对乳酸菌活菌数有显著影响(P<0.05)；A、A2、B2、C2对酵母菌活菌数有极显著影响(P<0.01)，C和BC对酵母菌活菌数有显著影响(P<0.05)。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental designs and results for response surface analysis

表3 回归方程方差分析†Table 3 Analysis of variance of regression model

† *. P<0.05，差异显著；**. P<0.01，差异极显著。

2.2.4 响应面优化及分析

(1) 三因素交互作用对活菌数的影响：如图2所示，发酵时间延长、温度升高，复合果蔬的乳酸菌、酵母菌活菌数先增大后减少；发酵时间延长，乳酸菌、酵母菌活菌数曲面坡度较大，说明样品活菌数受发酵时间影响显著；温度升高，乳酸菌活菌数先增多后减少，酵母菌活菌数先增多后急剧减少。接种量增加，开菲尔菌在发酵前期迅速产酸，发酵后期酸性物质积累过多，过酸环境不利于菌体生长[16]，致使活菌数随发酵时间的延长而减少。发酵温度升高，菌体活跃，但随着时间的延长，温度过高，开菲尔中的乳酸菌成为优势菌，而酵母菌细胞失活，提前衰老或死亡，所以产品中酵母菌活菌数大量减少[17]。

图2 三因素交互作用对开菲尔发酵复合果蔬活菌数的影响Figure 2 Surface response plots showing the effect of three factors on viable count

2.2.5 最佳发酵工艺的确定 由软件分析得到最佳发酵工艺为：发酵时间46.44 h、接种量8.01%、发酵温度30.81 ℃。考虑到可操作性，将最佳工艺调整为发酵时间46.4 h、接种量8.0%、发酵温度31 ℃，进行3次平行验证实验，测得发酵果蔬的乳酸菌活菌数7.58×1011CFU/mL，酵母菌活菌数7.41×1011CFU/mL。

2.3 体外功能评价结果

2.3.1 冻干后活菌数测定 测得冻干后产品乳酸菌、酵母菌活菌数分别为6.29×1011，6.22×1011CFU/g，乳酸菌、酵母菌活菌数存活率分别为83.0%和83.9%。

2.3.2 体外降糖试验 如图3所示，发酵及未发酵的冻干产品对α-淀粉酶都有抑制作用，且对α-淀粉酶抑制能力随样品浓度增加而增强，样品浓度为1，2，3，4，5 g/L时，发酵组α-淀粉酶抑制率比未发酵组高27.97%，17.87%，13.22%，15.18%，31.05%，发酵后复合果蔬冻干制品的降糖效用优于未发酵产品。未发酵及发酵样品IC50值分别为5.15，3.88 g/L，说明发酵样品对α-淀粉酶抑制效果优于未发酵样品。

图3 发酵及未发酵样品对α-淀粉酶抑制率的影响

Figure 3 The effect of fermented and unfermented samples on the inhibitory activity forα-amylase

2.3.3 体外降脂试验 由图4可知，发酵及未发酵样品结合牛黄胆酸钠作用均随浓度的增大而增强，样品浓度为1，2，3，4，5 g/L时，发酵组牛黄胆酸钠结合量比未发酵组高59.37%，26.37%，61.54%，60.83%，67.79%，存在极显著差异(P<0.01)。

2.3.4 体外抗氧化试验 由图5～7可知，复合果蔬冻干制品有较强的抗氧化性，样品浓度为1，2，3，4，5 g/L时，发酵组DPPH·清除率比未发酵组高7.45%，0.23%，1.82%，28.19%，13.41%，发酵组·OH清除率比未发酵组高2.53%，6.74%，11.11%，12.30%，19.36%，发酵组还原力比未发酵组高10.78%，53.90%，21.01%，32.56%，25.70%，其中，发酵组·OH清除率极显著高于未发酵组(P<0.01)。未发酵样品清除DPPH·、·OH和还原力IC50值分别为2.15，-0.70，7.58 g/L，发酵样品清除DPPH·、·OH和还原力IC50值分别为1.91，-0.11，5.80 g/L，说明发酵组抗氧化性优于未发酵组。

图4 发酵及未发酵样品对牛黄胆酸钠结合量的影响

Figure 4 The effect of fermented and unfermented samples on the binding amount of sodium taurocholate

图5 不同浓度样品对DPPH·的清除率

Figure 5 DPPH· removal rate of samples with different concentrations

图6 不同浓度样品对·OH的清除率

Figure 6 ·OH removal rate of samples with different concentrations

图7 不同浓度样品的还原力

Figure 7 The reducing ability of samples with different concentrations

3 结论

试验将开菲尔接入复合果蔬浆中进行发酵，再添加一定量的菊粉、低聚果糖和麦绿素，经真空冷冻干燥制成一款休闲健康的固体饮品。试验结果表明，开菲尔发酵复合果蔬最佳参数为发酵时间46.4 h、接种量8.0%、发酵温度31 ℃；发酵组冻干产品降糖、降脂和抗氧化性均优于未发酵组，说明开菲尔发酵使得整个体系降糖、降脂和抗氧化活性得到了提高。试验着重探索了苹果浆、番茄酱和沙棘原汁发酵工艺和冻干产品体外功能研究，并未对冻干产品进行感官评价，另外，发酵处理复合果蔬后添加菊粉、低聚果糖和麦绿素再经冻干可能有利于改善肠道菌群，但仍需通过动物试验进一步研究[18]。