吴茱萸不同提取部位致大鼠肝毒性研究

任晓静，李 明，张 逊，冯 昊，袁金斌

（1.唐山市协和医院药剂科，河北 唐山 063000；2.唐山市人民医院药剂科，河北 唐山 063000；3.江西中医药大学，南昌 330004）

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石 虎E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛吴茱萸Euodia Rutaecarpa （Juss.）Benth.var.bodinier（Dode）Huang 的干燥近成熟果实[1]。现代研究表明吴茱萸具有镇痛[2-3]、止呕[4-5]、抗炎、抗癌、抗增殖、抗感染、抗细菌等多种生物活性[6-7]，历代文献和2015年版《中国药典》（一部）均记载吴茱萸“小毒”或“有毒”，吴茱萸的主要成分为吴茱萸碱、吴茱萸次碱、和柠檬苦素等[4-6]。李文兰等[8]研究表明，吴茱萸喹诺酮类生物碱为肝毒性主要成分，对小鼠给药后，血清肝功能指标和肝脏指数升高，肝脏中央静脉及小叶下静脉周围肝细胞变形、灶性坏死，表明吴茱萸喹诺酮类生物碱毒性作用于肝脏。已有研究报道了吴茱萸水提物的肝毒性[9-10]、乙醇提取物的急性毒性和肝毒性作用[11]，本文对吴茱萸石油醚提取部位、正丁醇提取部位、水提取部位、氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位同时进行大鼠肝毒性研究，确定各提取部位的毒性强度，为进一步研究吴茱萸的毒性成分提供了依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 分析天平（AE-240，北京赛多利斯仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RE-52A，上海亚荣生化仪器厂）；高速冷冻离心机（SIGMA 公司）；AU480全自动生化分析仪（Beckman Coulter，USA）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；高速冷冻离心机（SIGMA-18，SIGMA 公司，德国）。

1.2 试药 吴茱萸药材采集于江西新干县淦川镇，经江西中医药大学杨武亮教授鉴定为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.的干燥近成熟果实；丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号：20150418）、天门冬氨酸转移酶（AST，批号：20150418），购于南昌百特生物高新技术股份有限公司；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯（西陇化工）；水为重蒸馏水。

1.3 实验动物 健康SD 大鼠，体质量为180～220 g，清洁级，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2013-0004。饲养温度（22±2）℃，自然照明，正常饲养。

2 方法

2.1 吴茱萸不同提取物浸膏制备 采用加热回流提取法，选取一定量吴茱萸药材，经烘干、粉碎，过三号筛备用，称取2.5 kg 吴茱萸药材粉末，加入20 L75%乙醇，加热回流1.5 h，按此方案再提取1次，时间1.0 h，将2 次提取液过滤，合并。剩余的残渣用10 倍量蒸馏水煎煮1.0 h，收集上层溶液后继续用蒸馏水煎煮0.5 h，水提取物合并过滤。乙醇萃取液经真空蒸馏后回收至无乙醇气味，并与水提液混合，浓缩干燥后得到吴茱萸浸膏，再用蒸馏水稀释，最后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，重复3～5 次，将各溶剂萃取液合并一起，得到5 种不同的提取部位溶液，回流浓缩萃取液，冷冻干燥，得5种不同提取部位浸膏，密封放置冰箱中保存，以备不同提取部位的毒性实验用。

2.2 动物分组与给药 随机挑选SD 大鼠160 只，雌雄各半，按随机分配法分为正常组1 组，实验组5 组，每组10 只，实验组包括石油醚提取部位、氯仿提取部位、乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位以及水提取部位的低、中、高3 个剂量组。以吴茱萸临床常用剂量为依据，按成人（60 kg）处方日用量（10 g）的临床等效量的1、2、4 倍设计，设定高、中、低剂量分别为3.46、1.73、0.87 g/kg，均按25 mL/kg 计算给药体积，给药组每天按时给予一定剂量的药物，对照组给予等体积的蒸馏水。实验期间主要观察大鼠的活动情况，毛色变化以及饮食情况，并记录。

2.3 生化指标检测 最后1 次给药前12 h 禁食，正常饮水，各剂量组大鼠灌胃给药，2 h 后取大鼠眼球静脉血，静置30 min 后离心，取上层血清，按相关试剂盒说明书要求进行检测，测定ALT、AST 活性。

2.4 组织病理学检查 大鼠取血后立即解剖大鼠，取大鼠肝脏，将周围结缔组织剔除后放入生理盐水中漂洗，然后用滤纸拭干表面液体，称重并计算其肝脏指数（肝脏系数=肝脏质量/体质量）×100%；另取肝脏右叶，以10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，用常规HE染色，光学显微镜下观察其组织形态学变化。

2.5 数据处理 用SPSS 17.0 统计软件对各参数进行单因素方差分析。

3 结果

3.1 一般情况观察 实验7 d 内，对照组大鼠活动正常、毛色光亮、饮水饮食均正常，无死亡。观察吴茱萸不同提取部位各剂量组大鼠，症状主要表现为腹泻、不活泼，毛色暗淡，进食饮水不良。称量大鼠体质量，各剂量组大鼠生长缓慢，同对照组比较，给药7 d 后乙酸乙酯、正丁醇各剂量组和水部位高剂量出现统计学差异。大鼠体质量信息见表1。

3.2 对大鼠血清生化指标的影响 对照组大鼠血清AST、ALT 数值均处于正常范围内。而吴茱萸不同提取部位的各剂量组血清AST、ALT 内水平均显著升高，与对照组数据相比较，具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01），其中石油醚提取部位高、中、低剂量组的AST、ALT 水平提高最为显著，其次依次为正丁醇提取部位、水提取部位、氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位，结果见表2。

表1 吴茱萸不同提取部位对大鼠体质量变化的影响（，n=10）

表1 吴茱萸不同提取部位对大鼠体质量变化的影响（，n=10）

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 吴茱萸不同提取部位对大鼠血清生化指标的影响（，n=10）

表2 吴茱萸不同提取部位对大鼠血清生化指标的影响（，n=10）

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.3 吴茱萸不同提取部位肝脏器指数检测 吴茱萸不同提取部位各剂量组均可导致肝/体比值增加，除石油醚低剂量组、氯仿低剂量组和正丁醇低剂量组外，其余各剂量组与对照组比较，呈现极显著性差异和显著性差异（P＜0.05，P＜0.01），且随着剂量增大，肝/体比值逐渐增加，呈现一定的剂量依赖关系，结果见表3。

表3 吴茱萸不同提取部位对大鼠肝脏器指数的影响（，n=10）

表3 吴茱萸不同提取部位对大鼠肝脏器指数的影响（，n=10）

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.4 对大鼠肝脏病理学影响 光镜下组织病理学检查发现，对照组肝脏无异常，肝小叶结构清晰完好，肝细胞未见明显变性、坏死，肝窦未见明显瘀血扩张，实验组中吴茱萸不同提取部位低、中剂量组的大鼠肝脏损伤未见明显异常，而高剂量组的大鼠肝脏出现不同程度损伤，主要表现为肝细胞肿胀，且有少部分可见小灶性或单细胞坏死，坏死细胞弥漫性存在于肝小叶中央，伴炎症细胞浸润，结果见图1。

图1 大鼠肝脏病理学切片结果

4 讨论

肝脏作为动物体重要的代谢器官，承担着机体重要的生理功能。容易受到外界因素的入侵而受损，肝脏的损伤主要分为暴力性肝损伤（如物理性损伤）和病理性损伤（包括化学性、药物性及酒精性肝损伤等），临床上血清中ALT、AST 的水平是检查肝损伤程度的重要指标。

本实验对吴茱萸不同提取部位均进行了肝毒性研究，以临床剂量下给大鼠灌服吴茱萸不同极性提取物，以ALT、AST 水平来衡量大鼠肝损伤大小，经过数据分析后对吴茱萸的肝毒性进行评价，通过对大鼠肝脏器指数的分析，结合肝脏切片的组织病理学检查，来评价吴茱萸各提取物对大鼠肝脏的损伤。生化指标结果得出，吴茱萸不同溶剂提取部位都显示有肝毒性，5个不同提取部位对大鼠肝毒性强度为：石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位＞氯仿部位＞乙酸乙酯部位。肝脏组织病理学检查结果发现高剂量组的大鼠肝脏出现不同程度损伤，主要表现为肝细胞肿胀，且有少部分可见小灶性或单细胞坏死，坏死细胞弥漫性存在于肝小叶中央，伴炎症细胞浸润，说明吴茱萸具有肝毒性。

吴茱萸主要化学成分为生物碱类物质、柠檬苦素类物质和挥发油类物质。有研究表明[8]，吴茱萸中喹诺酮类生物碱为主要肝毒性物质，由于石油醚提取物中喹诺酮生物碱含量较高，所以实验验证了石油醚提取部位肝毒性最强。临床上吴茱萸多以水煎液为药用剂型，用量因毒性受到限制，所以确定吴茱萸水提部位也具有毒性。吴茱萸毒性成分种类不明确，且各成分的毒性强度又有所不同，体现出吴茱萸各提取物均具有一定毒性。本实验通过对吴茱萸不同提取部位肝毒性考察，提供了吴茱萸肝毒性物质的基本信息，从而能进一步探求吴茱萸毒性成分，为吴茱萸中医临床安全有效用药提供科学依据，为同类有毒中药物质基础研究提供了思路。