内服外用对口腔黏膜溃疡大鼠模型作用及其对炎性介质的影响

王振国，董秀华，贾颖

(成都医学院第一附属医院，四川 成都 610500)

口腔溃疡属“口疮”“口糜”“口疳”等证范畴[1]，指以周期性反复发作为特点的口腔黏膜局限性溃疡性损害，多为圆形或椭圆形，有明显的灼痛，一般于7～10日自行愈合，但该病反复发作，愈合欠佳，具有自限性、周期性等特点，给患者生活带来严重困扰，影响患者生活质量[2]。目前，临床上大多采用减轻缓解疼痛的原则进行干预，并以预防复发为主。中医临床治疗口腔溃疡提倡内外联用，临床常用的外用口腔溃疡中成药有冰硼散、锡类散、养阴生肌散等[3]。基于此，本实验以冰硼散外用联合内服三黄泻心汤为基础，探讨内服外用对口腔溃疡(RAU)模型大鼠的治疗作用并探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠50只，体质量180 g～220 g，雌雄不限。购自成都达硕实验动物有限公司中心，合格证号：SCXK(川)2014-028。大鼠饲养温度(25±2)℃,相对湿度55%～70%，符合要求。

1.2 主要试剂与仪器

泻心汤：主要成分为大黄、黄连、黄芩；冰硼散(洛阳宁竹药业有限公司)；肿瘤生长因子α(TNF-α)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素10(IL-10)ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、显色剂DAB(南京建成生物工程有限公司)。

酶标定量测定仪(Thermo Multiskan AsCant公司)；多功能照相显微镜(日本Olympus)；离心机5415D(Eppendorf公司，德国)；超薄石蜡切片机(德国徕卡)。

1.3 溃疡模型建立

50只SD大鼠，适应性喂养后，随机分为正常组(A)、模型组(B)、冰硼散组(C)、三黄泻心汤组(D)、冰硼散+三黄泻心汤组(C+D)共5组，各组10只。正常组进行常规喂养，不予任何处理；B组、C组、D组、C+D组采用化学烧灼法建立口腔溃疡动物模型。方法：将大鼠固定，以1%戊巴比妥钠(0.025 g/kg)麻醉，以蘸有NaOH晶体的滤纸(直径3 mm)在下唇靠口角黏膜处烧灼5 s～8 s，生理盐水冲洗，1天后形成溃疡。每只动物溃疡面应尽量在同一部位，大小、深度尽量一致[4]。其中C组、C+D组，给予冰硼散以覆盖创面为度，D组及C+D组在以1 g/kg灌胃2 mL三黄泻心汤药液，A组与B组采用相应体积生理盐水灌胃，各组连续治疗6 d。

每组10只大鼠，1只用于HE染色，剩余9只用于第6天ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-2、IL-10含量及其他课题组中涉及的考察指标。

1.4 溃疡组织HE染色

给药6天后，各组大鼠随机选取1只采用颈部脱臼法处死，剪下溃疡组织，面积为0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm，将剪下的溃疡组织用磷酸盐缓冲液PBS反复冲洗，清洗完成后置入4%多聚甲醛固定，24 h后将固定的组织置入自动组织脱水机中进行梯度酒精脱水、然后以二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋等步骤；经组织切片(5 μm)、摊片、捞片、烤片后，脱蜡至水。苏木精染色、盐酸分化、再以流水冲洗，冲洗完成后用酒精脱水，使用伊红溶液染色，使其上色便于拍照。最后再以梯度酒精脱水，二甲苯透明、中性树胶封片，最后置于多功能照相显微镜下观察、拍照[1]。

1.5 溃疡的形成及愈合情况

实验期间，定期观察并记录溃疡从发生至愈合的时间、溃疡形状及愈合状态等，用游标卡尺测量溃疡的直径并计算其面积，直至给药结束。

1.6 炎性介质的水平变化

给药6天后，收集各组大鼠血清，采用考马斯亮兰法测定各炎性介质的水平。按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，反应终止后，在酶标仪设置450 nm波长，测量各孔的光密度(OD值)，检测组织中炎性介质TNF-α、IL-2、IL-10含量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 HE染色结果比较

A组大鼠正常饲养，其口腔黏膜组织上皮完整、连续，细胞排列整齐、有序，胞核胞浆无异型性。B组大鼠，造模后不予给要处理，可看到其口腔黏膜被破坏，细胞排列，不规则，溃疡呈圆形或椭圆形，溃疡组织周围边缘充血、红肿，同时黏膜的表面覆有灰黄或灰白色膜。C组、D组、C+D组在造模后进行药物干预，给药6 d后，3组大鼠的溃疡面积均呈缩小趋势，同时有新生疤痕膜覆盖，充血症状减轻，渗出物减少；联合给药(C+D组)的大鼠，溃疡症状减轻程度大于C组或D组，并伴有部分新生肉芽产生。见图1。

图1 各组大鼠口腔黏膜组织病理染色(HE，×100)

2.2 各组溃疡面积变化情况比较

具体数据如表1所示，与模型组比较，给药第1天，各给药组溃疡面积均无明显变化，从第2天起，各给药组的口腔面积均较模型组有所减小，且随时间逐渐好转，到给药第6天，各给药组与模型组比较，口腔溃疡面积均显著缩小，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；但C组、D组之间无明显差异，C+D组较C组或D组均有显著改善，异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠溃疡面积变化

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与C组比较，△P<0.05；与D组比较，￥P<0.05。

2.3 各组血清中TNF-α、IL-2、IL-10含量比较

各组血清中TNF-α、IL-2、IL-10水平的变化见表2。给药后6 d，与空白组比较，模型组与各给药组的炎性因子TNF-α、IL-2、IL-10含量均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，各给药组的炎性因子TNF-α、IL-2、IL-10水平显著降低，差异有显著性(P<0.05)；其中，C+D组(内服+外用组)的炎性因子水平显著低于C组/D组(内服或外用)(P<0.05)。

表2 各组血清中TNF-α、IL-2、IL-10的水平变化

注：与空白组比较，☆☆P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与C组比较，△P<0.05；与D组比较，￥P<0.05。

3 讨论

中医学认为口腔溃疡属“口疮”范畴，口疮的产生主要是由外感邪热、心脾积热；或阴虚阳亢、虚阳浮越等造成的虚火上浮或邪热上蒸导致[5-7]，病程缠绵难愈。三黄泻心汤主要由大黄、黄连、黄芩组成，三者均具有清热燥湿、泻火解毒等功效。现代药理研究显示，黄连的主要成分(小檗碱型化合物)，在分子结构特点上均属异喹啉类生物碱，具季铵基团。在抗炎方面，三黄泻心汤具有较好的疗效[8]。冰硼散，由玄明粉、硼砂、朱砂粉、冰片组成，具有清热解毒、消肿止痛、祛腐生肌的作用，主治咽喉口齿新久肿痛及久嗽痰火，音哑咽痛，为口齿及喉科要药[9]。内服外用使用能达到双倍的功效，加快发挥消肿止痛、清热收敛的功效，使溃疡得治。口腔黏膜直接灼伤，热邪日久损伤正气，形成局部津液不足，临床表现为口腔溃疡、咽喉红肿热痛、口干等阴虚内热之象。基于此，本课题以外用冰硼散与内服三黄泻心汤联用的方式进行实验研究，探讨其治疗作用及部分抗炎机制。

炎性介质IL-2是辅助性T细胞所分泌的重要淋巴因子之一，IL-2已成为机体免疫系统中极为重要的抗肿瘤、抗感染、抗衰老介质[10]。研究显示，IL-2可以促进T细胞增殖，增强T细胞活性，有调节免疫功能作用，调控组织修复过程，有益于创伤修复，促进口腔溃疡愈合[11]。IL-2活性水平降低会导致免疫网络中的某一环节或某些环节发生障碍，以致造成机体免疫功能异常而导致发病。本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠IL-2活性水平明显下降，各给药组的IL-2水平均较模型组有所升高，表明口腔溃疡大鼠辅助性T细胞功能低下，给药后，功能增强，说明辅助性T细胞功能低下可能是口腔溃疡发病的一个重要原因。

炎症介质TNF-α和IL-10是参与口腔溃疡形成过程中的具有代表性的主要炎症细胞因子[12]，其水平高低与病情轻重密切相关，即溃疡数目越多，溃疡面积越大，TNF-α和IL-10含量越高[13]。炎性介质IL-10主要由单核-巨噬细胞产生，当机体受到外界刺激时，该介质具有广泛的促炎作用。本研究结果表明，C组或D组以及C+D组均能显著抑制炎性介质TNF-α、IL-10的水平；在不断给药过程中，溃疡逐渐愈合，机体炎症症状减轻炎性介质水平明显降低，且联合用药的溃疡愈合能力优于单独外用或内服。

综上所述，对于口腔溃疡的治疗，可选择内服外用联合用药，对于减轻的症状，减少发病时间、有效抑制反复发作具有双倍的作用。