均匀设计法优选山茱萸九蒸九晒炮制工艺

马彦江，陈天朝，鲁静，于兰兰，王娇，姚超，牛晓静*

(1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；2.河南省直第三人民医院，河南 郑州 450006；3.驻马店市中医院，河南 驻马店463000；4.河南中医药大学，河南 郑州 450008)

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉[1]，最早收载于《神农本草经》，其味酸、涩，微温，归肝、肾经，具有补益肝肾、收涩固脱的功效，临床常用于眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩漏带下，大汗虚脱，内热消渴等证，现代药理研究其具有抗心律失常、降血糖、保肝、抗氧化、抗衰老、调节免疫等作用[2-4]。

九蒸九晒指采用蒸法和晒法反复炮制中药材，具体细节因药材品种不同而不同，主要目的是纠偏药材药性或增加药效成分。传统的九蒸九晒品种主要有何首乌、地黄、黄精、黑芝麻等[5]，九蒸九晒后均具增强补益的作用。鉴于酒炙后的山茱萸也增强了补益肝肾作用[6]，国家级非物质文化传人朱清山依据自己多年经验开发出九蒸九晒山茱萸，但炮制技艺局限于个人经验，缺乏客观可控的参数。基于中药具有多成分、多靶点的作用特点，因此本实验以水浸出物、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、多糖的含量为指标，运用均匀设计法，考察黄酒用量、焖润时间、蒸制时间和蒸制次数等工艺参数，以期得到九蒸九晒山茱萸最佳炮制工艺。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Thermo Evolution 201紫外分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)；UltiMate 3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；Hk250型科导台式超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；HH-S4A电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)；LXJ-IIB型离心机(上海安亭科学仪器厂)；FW-500型高速万能粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)。

1.2 材料

5-HMF(批号：A22J7L166074，质量分数≥98%),马钱苷(批号：R23D7F27552，质量分数≥98%)，D(+)﹣无水葡萄糖对照品(批号：S08J6G1，质量分数≥98%)(上海源叶生物科技有限公司)；莫诺苷(批号：17051604，质量分数≥98%，成都普菲德生物技术有限公司)；乙腈、磷酸为色谱纯；水为超纯水；黄酒(浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司)；其他试剂均为分析纯。

山茱萸(批号:1702091，安徽普仁中药饮片有限公司)，经河南中医药大学第一附属医院药学部陈天朝主任药师鉴定为山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉。

2 方法与结果

2.1 水浸出物测定

山茱萸水浸出物含量按照《中国药典》2015年版四部通则2201项下水溶性浸出物测定法的冷浸法测定。

2.2 5-HMF、莫诺苷、马钱苷的测定

2.2.1 色谱条件

采用Agilent 公司Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.3%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～20 min，7%A；20～50 min，7～20%A)，流速为1.0 mL/min，检测波长为240 nm，柱温为35 ℃，进样量为10 μL。5-HMF、莫诺苷和马钱苷混合对照品及山茱萸九制品的HPLC色谱图见图1。结果表明，样品中的其他成分不干扰5-HMF、莫诺苷和马钱苷的测定。

2.2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取5-HMF、莫诺苷和马钱苷的对照品适量，用80%甲醇配成浓度分别为1.505、0.510和0.505 mg/mL的混合对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称定均匀试验样品(1～8号)约0.2 g，置锥形瓶中，加入80%甲醇25 mL，称重，回流1 h，放凉，再称重，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即可。

2.2.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取对照品储备液1、2、4、6、8、10 mL，置于6个50 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，配制成一系列浓度的标准溶液，进样测定，以对照品的浓度(C)为横坐标，以峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

2.2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(6号样品)10 μL，连续进样6次，测得5-HMF、莫诺苷和马钱苷峰面积的RSD分别为0.8%，0.6%和0.5%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液(6号样品)，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h后进样测定，记录峰面积。结果5-HMF、莫诺苷和马钱苷峰面积的RSD分别为1.1%，1.4%和1.2%，表明供试品溶液中3种成分在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验

取同一供试品溶液(6号样品)，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得到样品中5-HMF、莫诺苷和马钱苷含量的平均值分别为2.12%，0.66%和0.76%，RSD分别为1.3%，1.0%和1.1%，结果表明，该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验

精密称取山茱萸样品(6号样品)1 g，共6份，分别加入对照品储备液1 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，5-HMF、莫诺苷和马钱苷的平均回收率分别为98.1%，97.3%和98.9%，RSD分别为3.15%，2.23%和2.86%，结果表明，该方法的回收率较好。

图1 5-HMF、莫诺苷和马钱苷混合对照、山茱萸九制HPLC色谱图

2.2.9 样品含量测定

取均匀试验样品(1～8号)，按“2.2.3”项下方法分别制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品中5-HMF、莫诺苷和马钱苷的含量。

2.3 多糖的含量测定

2.3.1 0.1%蒽酮硫酸溶液的配制

准确称取蒽酮0.1 g，加入80%的硫酸溶液100 mL，使溶解，即得，现用现配。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，摇匀，制成每1 mL含0.107 mg的葡萄糖溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备

精密称定均匀试验样品(1～8号)约2 g，加8倍量95%乙醇，回流8 h脱脂，药渣挥干，用20倍量蒸馏水在80 ℃回流提取2.5 h，趁热过滤，提取2次，合并滤液，定容至100 mL，取水煎液10 mL，加入4倍量无水乙醇，4 ℃放置过夜，离心，弃去上清液，沉淀用水溶解，转移并定容至100 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.3.4 标准曲线的绘制

精密吸取葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL具塞刻度试管，加水至2 mL，摇匀，迅速精密加入0.1%蒽酮硫酸溶液6 mL，混匀后于沸水浴中加热15 min，取出，立即置于冰水浴中冷却15 min，取出，以相应的试剂为空白，在625 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度(C)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线为：A=11.279C+0.020 6(R2=0.999 1)，结果显示吸光度与无水葡萄糖在0.010 7～0.064 2 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验

精确吸取同一供试品溶液(6号样品)2 mL，按照上述蒽酮硫酸法显色，并测定吸光度，重复平行实验6次，记录吸光度，得到RSD为0.37%，结果表明，该仪器的精密度好。

2.3.6 稳定性试验

精确吸取同一供试品溶液(6号样品)2 mL，按上述蒽酮硫酸法显色，并测定吸光度，每隔10 min测定1次，60 min内RSD为0.69%，结果表明，该供试品溶液在60 min内的稳定性较好。

2.3.7 加样回收率试验

精密称取山茱萸样品(6号样品)1 g，共6份，分别精密加入葡萄糖对照品溶液(17.39 mg/mL)1 mL，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按上述蒽酮硫酸法显色并测定吸光度，多糖的平均回收率为97.3%，RSD为4.23%，结果显示，证明该方法的回收率较好。

2.3.8 样品含量测定

精密量取供试品溶液2 mL，置于10 mL具塞刻度试管，摇匀，迅速精密加入新配制的0.1%蒽酮硫酸溶液6 mL，混匀后于沸水浴中加热15 min，取出，立即置于冰水浴中冷却15 min，取出，在625 nm处测定吸光度。根据标准曲线计算供试品溶液中多糖含量。

2.4 均匀试验设计

表2 因素水平表

表3 均匀设计试验及结果

利用SPSS 22.0对试验数据进行二次多项式回归分析处理，得到回归方程为：Y=49.961+18.314X3+6.249X4-3.131X3X4，R=0.954，P=0.015<0.05，表明回归方程拟合度高，且具有统计学意义。X3与X4存在交互作用。X3X4的系数为负值，说明各指标成分提取率呈负相关；X3，X4的系数为正值，说明其与各指标成分提取率呈正相关。

根据回归方程，可得山茱萸最佳九蒸九晒工艺为黄酒用量15%、焖润时间1.5 h、蒸制时间1.5 h、蒸制次数9次。

3 工艺验证

取山茱萸100 g，共3份，按照“2.5”项下所得到的最佳工艺条件进行验证试验，对山茱萸九制品中有效成分的含量进行测定，结果见表4。结果表明，优选的工艺稳定、可行。

表4 工艺验证结果

4 讨论

九蒸九晒作为中药特色炮制技术，具有悠久的历史和深厚的文化底蕴。始见于唐朝孟诜的《食疗本草》，其中记载了九蒸九晒黄精的炮制方法及功效。经后世历代医药学家发扬光大，九蒸九晒的中药品种逐步增加，炮制工艺和辅料选择进一步细化。早在清朝时期，河南省禹州赵隆太药行的九蒸九晒地黄就在柏林的“万国博览会”上获得金奖，被称为“隆熟地”，但后因多种原因九蒸九制九蒸九晒工艺失传。2006年，国家级非物质文化传人、老药工朱清山先生依据自己多年经验成复制出“黑如漆、光如油、甘如饴”的古法九蒸九晒熟地，并在此基础上开发出九蒸九晒槐角、山茱萸等品种。但受历史条件、认知能力及科学水平的限制，目前可参照的九蒸九制炮制工艺仍以来经验判别，且工艺繁琐、效率低下，缺乏客观可控的参数，质量控制点仅凭外观性状、口感等传统经验，缺乏数字化、标准化的炮制工艺标准。随着“健康中国”战略的实施和民众对养生的重视，古法炮制中药迎来了发展的春天，传统经验炮制工艺技术已不能满足市场需求和食药监管的要求。因此，建立数字化、标准化的九蒸九晒炮制工艺，对中医药文化的传播、中药炮制技术的传承、古法炮制中药饮片的品牌树立具有重要意义。

山茱萸富含酯类、五环三萜类、鞣质和多糖等活性成分。研究发现莫诺苷具有神经保护作用[7-9]，马钱苷具有免疫调节、抗休克、抗过氧化等作用[10]，2015年版《中国药典》也把环烯醚萜苷类化合物莫诺苷和马钱苷作为山茱萸的定量指标。研究发现山茱萸多糖具有提高免疫、抗炎、抗衰老和抗氧化、提高骨髓造血及抗肿瘤细胞的作用[11]，是其补益肝肾的主要物质基础；5-HMF是中药炮制加热过程中发生的美拉德反应的典型产物，是炮制程度的指标性成分，也是山茱萸炮制后补益肝肾作用增强的物质基础之一[11-15]。基于中药具有“整体性、多靶点、协同性”的特点，故本试验选择水浸出物、莫诺苷、马钱苷、5-HMF和多糖的含量作为综合评价指标进行炮制工艺研究。

本实验研究发现黄酒用量、蒸制时间、蒸制次数3个因素间存在交互作用，与传统炮制经验相符。经过试验，最终优选出九蒸九晒山茱萸的最佳工艺为黄酒用量15%、焖润时间1.5 h、蒸制时间1.5 h、蒸制次数9次。验证实验证实该方法稳定、可行，将为九蒸九晒山茱萸炮制工艺研究和炮制品质量评价提供了数据支撑。