EGCG及其络合物EGCG-Cu的消毒效果研究

庆杉，赵岩，冯萃敏，段鹏鑫，王婷，张欣蕊，丁梓沁

(1.北京建筑大学 北京未来城市设计高精尖创新中心，北京 100044；2.北京建筑大学 水环境国家级实验教学示范中心，北京 100044；3.北京外交人员服务局，北京 100010；4.河北经贸大学 数学与统计学学院，河北 石家庄 050061；5.北京市市政工程设计研究总院有限公司，北京 100082)

为解决饮用水消毒过程中产生的多种对人体有毒有害的消毒副产物问题[1-3]，采用表没食子儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate，EGCG，茶多酚中起抑菌作用的主要成分[4-12])替代传统消毒剂，但其稳定性较差。在初始浓度大、pH高、光照条件下易发生氧化聚合反应[13]，降低抑菌能力[14]。

为增强EGCG的化学稳定性及杀菌能力，选用Cu2+为中心离子[15]，EGCG为配体，采用水热法进行络合[16]。选用饮用水卫生标准微生物指标中最具有代表性的细菌——大肠杆菌，探索络合物EGCG-Cu的抑菌性，以及初始投加量和反应时间对消毒效果的影响，为茶多酚及EGCG在饮用水消毒领域的应用拓展出一条新的道路。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

大肠杆菌(编号10004)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG为南京广润生物制品有限公司产品(编号GR0799)；氯化钠、硫酸铜、碳酸氢钠、乙醇均为分析纯；营养肉汤培养基和营养琼脂培养基，均为人工配制。

BCN-1360型生物操作台；SPX-250B-Z型生化培养箱；灭菌锅(日本，三洋，75 L)；78HW-1恒温磁力搅拌器；台式恒温摇床(杭州得聚仪器设备有限公司)；酶标仪(ThermoFisher，Multiskan FC)。

1.2 溶液配制

1.2.1 营养肉汤培养基 3.6 g肉汤培养基(试剂)溶于200 mL蒸馏水，用电炉加热至沸腾，再入高压灭菌锅灭菌备用。

1.2.2 营养琼脂培养基 6.6 g营养琼脂，200 mL蒸馏水，步骤同营养肉汤培养基。营养肉汤培养基和营养琼脂培养基均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2.3 无菌生理盐水 1.7 g氯化钠，用去离子水定容于200 mL，121 ℃灭菌30 min。选用蒸馏水作为配制菌液、溶解药剂等实验用水。

1.3 实验方法

1.3.1 EGCG-Cu络合物的制备 采用水热法合成所需络合物。称取EGCG 0.5 mmol，用30 mL的蒸馏水溶解，并将1 mmol的硫酸铜配制成溶液后逐滴加入，待混匀后用1 mol/L的碳酸氢钠将pH调节至7，在40 ℃温度下用恒温磁力搅拌器搅拌1 h使其充分络合，后用1∶1的乙醇-水溶液多次洗涤沉淀，真空冷冻干燥后得EGCG-Cu。络合反应见图1。

图1 EGCG与Cu2+的络合反应Fig.1 Complexation reaction between EGCG and Cu2+

1.3.2 菌悬液的制备 用接种环从含有大肠杆菌的琼脂斜面刮取一环，溶于营养肉汤培养基中，培养条件为：温度(37±2) ℃，220 r/min的恒温摇床中培养，时间为(8±1) h。此时的菌数约为103～109 CFU/mL。若需稀释，用灭菌的移液枪吸取1 mL原始菌液加入到无菌生理盐水中作梯度稀释，并用平板计数法记录细菌数，直至实验所需细菌浓度。

1.3.3 最小抑菌浓度(MIC)测定 采用平皿计数法，通过对比EGCG的菌落的生长状况来判断EGCG-Cu是否具有抑菌效果。用生理盐水将大肠杆菌菌悬液稀释至104数量级，取EGCG-Cu络合物溶液的浓度为0,12.5,25,50,100,200,400 mg/L，EGCG溶液的浓度为0,125,250,500,1 000,2 000,4 000 mg/L，对大肠杆菌进行接触时间为24 h，培养温度为37 ℃的抑菌实验，观察菌落的生长情况。

1.3.4 抑菌性能影响因素分析 探究EGCG-Cu投加量和反应时间对其抑菌效果的影响。设置EGCG-Cu的投加量为0,25,50,75,100,150,200,250,400,600,800,1 000 mg/L，将大肠杆菌菌悬液稀释至103数量级，加入EGCG-Cu络合物的溶液，反应时间2 h，温度为37 ℃。选取EGCG-Cu的投加量为25,50,75,100 mg/L，观察其在反应时间为15,30 min,1,6,12,24 h时的抑菌效果。为得到比较直观的实验结果，选用EGCG做对比实验，EGCG的投加量选为200,400,600,800 mg/L。

1.3.5 EGCG-Cu诱导大肠杆菌胞内产生活性氧簇(ROS) 采用活性氧酶联免疫分析试剂盒进行检测，将大肠杆菌培养至对数期，按说明书用缓冲液稀释后，取0.1 mL加入反应孔中，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液清洗3次。将稀释过的待检样品0.05 mL加入已包被单抗微孔中，置37 ℃孵育1 h，然后洗涤(同时做空白对照孔)。在各孔中加入现配的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃孵育20 min后，加入2 mol/L硫酸0.05 mL终止反应。在酶标仪450 nm波长下测定OD值，根据标准曲线计算测试样品中的活性氧簇含量。

2 结果与讨论

2.1 EGCG-Cu和EGCG 的最小抑菌浓度(MIC)

最小抑菌浓度MIC是将制备的一系列药剂稀释液加入到有试验菌的固体或液体营养培养基中，在一段时间的培养后，观察实验菌是否有生长，可完全抑制实验菌生长的最低药物浓度即为最小抑菌浓度，用于定量测定药剂的抗菌活性[17]。按上述实验方法配制一系列浓度的EGCG和EGCG-Cu溶液进行MIC实验。

实验表明，EGCG-Cu在浓度为200 mg/L时无菌落长出，EGCG在浓度为1 000 mg/L时无菌落长出，EGCG-Cu的最小抑菌浓度远小于EGCG。由此可知，EGCG-Cu络合物不仅具有抑菌能力，而且明显优于EGCG。EGCG-Cu优异的抑菌能力可能是因为革兰氏阴性菌大肠杆菌的细胞表面有带负电的脂多糖，而在生理pH下，EGCG不带电，EGCG-Cu络合物却带正电荷。大肠杆菌表面的负电荷可能会吸引EGCG-Cu，导致EGCG更易于破坏大肠杆菌的生物膜[18]，从而提高了抑菌效率。这与Sun等的研究一致[16]。也可能由于EGCG-Cu络合物游离出的Cu2+氧化成Cu+，促进了氧化聚合反应的链引发阶段的发生，从而使杀菌效果有所提升。这与冯萃敏等学者建立的EGCG氧化聚合反应衰减模型相吻合[14]。

2.2 EGCG-Cu和EGCG 投加量对其抑菌性能的影响

EGCG-Cu和EGCG对大肠杆菌均有明显抑菌作用，并且EGCG-Cu的抑菌效果较EGCG更优。由图2可进一步得知，当EGCG-Cu初始浓度达到150 mg/L时，细菌完全杀灭，抑菌率达到100%。初始浓度在100 mg/L时，抑菌率为95%。即使初始浓度在50 mg/L时，其对大肠杆菌的杀灭效果也很明显，抑菌率也达到60%。对比EGCG不同浓度下的抑菌率可以看出，EGCG-Cu在较低的浓度下就可有效杀灭大肠杆菌，达到较好的抑菌效果。

图2 EGCG-Cu络合物和EGCG的浓度与抑菌率关系Fig.2 The disinfection performance of EGCG-Cu and EGCG

2.3 反应时间对EGCG-Cu和EGCG抑菌性能的影响

EGCG-Cu和EGCG在初始24 h的抑菌率见图3和图4。

由图3可知，在0～6 h内，EGCG-Cu的消毒效果受接触时间的影响显著，在12 h左右达到最大值并且趋于平稳。低初始浓度的EGCG-Cu的抑菌能力受反应时间的影响较大，如初始浓度在25 mg/L时，15 min至6 h内，其抑菌率增加了60%。而随着EGCG-Cu的初始浓度的提高，如100 mg/L时，由于EGCG-Cu在15 min时就达到了84%的抑菌率，所以在15 min至6 h内其抑菌率仅增加了9%。综上所论，EGCG-Cu在初始浓度为100 mg/L时，在较短时间(15 min)就能到达较好的抑菌效果。在较低初始浓度25 mg/L时，虽短时间(15 min)的抑菌率仅为14%，但随着反应时间的增长，在6 h时能达到74%的抑菌效果并趋于稳定。对比EGCG的抑菌过程，由图4可知，EGCG-Cu和EGCG均是在6 h左右达到较稳定的抑菌效果，而且在达到较好的抑菌率的同时，EGCG-Cu的投加量远小于EGCG的投加量。

图3 EGCG-Cu在初始24 h的消毒效果Fig.3 Bacteriostatic rate of EGCG-Cu in the initial 24 h

图4 EGCG在初始24 h的消毒效果Fig.4 Bacteriostatic rate of EGCG in the initial 24 h

2.4 EGCG与EGCG-Cu诱导产生活性氧簇情况的比较

图5 EGCG和EGCG-Cu诱导大肠杆菌产生活性氧簇量Fig.5 EGCG and EGCG-Cu induce E.coli to produce ROS

3 结论

以大肠杆菌作为细菌灭活效果的指示菌，探究了EGCG-Cu和EGCG的消毒效果，并对初始投加量、反应时间等影响因素进行了研究，并对EGCG-Cu消毒效果优于EGCG的成因进行了初探，所得结论如下：

(1)实验表明EGCG-Cu的最小抑菌浓度小于EGCG，抑菌性优于EGCG。

(2)EGCG-Cu和EGCG的消毒效果均与其初始投加量呈正相关。在抑菌过程中，EGCG-Cu和EGCG均是在反应6 h时达到较稳定的抑菌效果。

(3)相同的消毒效果所需EGCG-Cu或EGCG的投加量不同，EGCG-Cu的投加量远小于EGCG。

(4)对EGCG-Cu和EGCG的抑菌机理分析表明，EGCG-Cu与EGCG相比，在消毒过程中可持续引起大肠杆菌胞内产生过多的活性氧簇，使菌体的抗氧化系统崩溃，造成菌体死亡。这个过程开始阶段主要是EGCG-Cu释放出的Cu2+发生类芬顿反应，产生的超氧化物。Cu2+降低后促进发生链反应起主要作用，发生氧化反应生成EGCG醌和·O2-，持续使大肠杆菌体内产生活性氧簇，从而产生更强的杀菌效果。

综上表明，与金属离子络合是改进EGCG消毒效果的有效途径，EGCG-Cu在用量少和消毒效果好方面均体现出明显优势。