调脂通脉解毒方对脑缺血再灌注大鼠炎症因子及脑梗死体积的影响

孙琛琛，方晓磊*，杨惠民，刘福生，刘陟，崔瑞刚，吴笛，刘重琪，李中康

(1.北京中医药大学东方医院，北京 100078；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700)

脑梗死是我国的常见病和多发病，急性脑梗死发病率约为12.5%，其致残率、致死率均较高[1]，给社会和家庭带来了极大的负担，卒中后大多伴精神状态的改变，给患者身心带来极大的伤害[2]。脑梗死的过程是脑动脉粥样硬化和血管内膜受损在局部形成血栓，使动脉管腔狭窄，进而闭塞血管，使脑组织缺血缺氧而坏死，最终导致神经功能障碍，严重影响患者的生存质量，给社会和家庭带来了极大的经济和心理负担[3]。脑缺血再灌注损伤过程是自由基因缺血、缺氧一段时间后血液重新供应而过量释放，从而攻击脑组织细胞，主要集中在重新获得血液供应的脑组织细胞[4]。其过程是一个快速的级联反应，包括诸多环节，如炎性细胞浸润[5]、能量代谢障碍、细胞凋亡、细胞水肿[6]、自由基生成等，因此要减轻脑缺血再灌注损伤，控制炎症反应是关键[7]，调脂通脉解毒方是由调脂通脉颗粒演变而来，具有益气活血化痰解毒的作用。本课题利用线栓法形成大鼠脑缺血再灌注损伤模型，研究调脂通脉解毒方对脑缺血损伤大鼠hs-CRP、Lp-PLA2炎症因子影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤的保护作用；并应用TTC染色法对大鼠的大脑进行染色，观察大鼠大脑梗死体积，从而探讨调脂通脉解毒方对于脑缺血脑梗死体积的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级(SPF级)SD大鼠120只，雄性，体质量(220±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号:SCXK(京)2016-0006。本实验符合中国伦理委员会动物研究指导原则的相关规定，经过本单位实验动物伦理委员会批准(201814)。

1.2 药物与试剂

调脂通脉解毒方：以益气活血化痰、通脉解毒为原则，由太子参、黄芪、丹参、半夏、草决明、土茯苓等组成。本实验采用北京中医药大学东方医院制剂室制作的颗粒剂，批准文号:(98)京卫药制字〔052〕第F-1266号。

尼莫地平(天津中央药业有限公司，批号：15150044，30 mg/片)；大鼠hs-CRP、Lp-PLA2 ELISA试剂盒(北京欧北生物科技有限公司，批号：20150128)；氯化三苯基四氮唑(TTC染色液)(美国Sigma公司)；3600AAA 尼龙线栓(广州佳灵生物技术有限公司)。

1.3 主要仪器

Max-M5酶标仪(美国Thermo公司，1510)。

1.4 造模与分组

1.4.1 造模

1)称重并麻醉：用电子秤称重并记录，应用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为0.35 mL/100 g，然后放入提前备好的鼠笼。

2)采用MCAO法造模，即大脑中动脉闭塞法。用分离器分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎右侧颈总动脉、颈外动脉，然后用动脉夹子夹闭右侧颈内动脉，用眼科剪在右侧颈总动脉血管剪一小口，将线栓插入至大脑中动脉起始端，2 h后，将线栓抽出并结扎开口，实现再灌注缺血再灌注，假手术组不插入线栓[8]。

3)评分：应用Zea-Longa的评分方法[9]进行神经功能评分，五级四分法，评分≥2分的的大鼠为造模成功，可以用于后期实验。

1.4.2 分组

随机分为假手术组、模型组、调脂通脉解毒方低剂量组、调脂通脉解毒方中剂量组、调脂通脉解毒方高剂量组、尼莫地平组。每组20只。

1.5 实验给药

假手术组给予等体积溶媒；模型组给予等体积溶媒；调脂通脉解毒方低剂量组给予20 mg/(kg·d)调脂通脉解毒方；调脂通脉解毒方中剂量组给予40 mg/(kg·d)调脂通脉解毒方；调脂通脉解毒方高剂量组给予60 mg/(kg·d)调脂通脉解毒方；尼莫地平组给予15 mg/(kg·d)尼莫地平。给药时间为术后14 d，灌胃给药，每天1次。

1.6 观察指标

1.6.1 脑组织生化指标检测

将各组大鼠随机取7只大鼠麻醉后断头取脑；准确称取部分脑组织后，按照1:9加入预冷至4 ℃的生理盐水，匀浆后取上清，分装、冻存。按照试剂盒说明书中的操作，采用放射免疫法测定hs-CRP及Lp-PLA2含量。

1.6.2 大鼠大脑TTC染色

1)切片：灌胃2周后，在不同时间点每组大鼠取3只立即断头取脑，20 ℃冰箱中速冻20 min左右,便于切片。

2)避光温育：将脑切片置于2%、37 ℃的TTC溶液中，避光温育30 min。

3)固定：多聚甲醛中固定(PBS配置，浓度1%)。

4)计算面积：观察大鼠颅脑切片，取最大层面，扫描照片，应用Lcica图像处理系统测定脑梗死面积，利用公式计算体积和百分比(梗死体积/对侧脑片体积×100%)，表示损伤程度[10]。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠hs-CRP、Lp-PLA2表达情况比较

结果见表1和图1、图2。与假手术组比较，模型组、尼莫地平组、调脂通脉解毒方各组大鼠脑组织hs-CRP、Lp-PLA2含量均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，调脂通脉解毒方各组、尼莫地平组hs-CRP、Lp-PLA2含量均显著降低(P<0.01)。

表1 各组大鼠hs-CRP、Lp-PLA2表达情况比较

注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

图1 各组大鼠hs-CRP含量比较

图2 各组大鼠Lp-PLA2含量比较

2.2 各组大鼠TTC染色的结果

结果图3和表2。除假手术组外其余各组均出现脑梗死情况，与模型组比较，调脂通脉方高、中、低剂量组和民莫地平组均能显著改善脑梗死情况，其中以高剂量组最优。

表2 各组大鼠脑梗死体积及百分比情况比较

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

脑缺血造成的血液循环障碍会使脑组织在缺血、缺氧的情况下诱发无氧酵解，发生时出现局部微循环障碍，造成脑组织缺血、缺氧从而引发无氧糖酵解，产生大量的乳酸、炎症因子等炎症介质，引发细胞肿胀，最终导致细胞坏死和细胞凋亡[11]。

图3 各组大鼠TTC染色的结果

恢复脑血流是缓解和避免脑损害的方法,但脑缺血再灌注却能引起脑损伤，脑缺血再灌注损伤的病理和生理过程复杂，有很多学说，其中炎症反应是重要的一环是许多专家的共识[12]。

炎症反应是脑缺血再灌注损伤最重要的部分，高敏C反应蛋白(hs-CRP)[13]是目前检测机体炎症反应最敏感的指标，hs-CRP是高敏反应蛋白，与人们所熟悉的CRP关系密切，是一种细胞因子，也是最近比较热点的炎症因子[14]。有研究表明,hs-CRP 可以透过血脑屏障，直接进入脑脊液，成为脑组织损伤的重要标志物，对于评估急性脑梗死病灶大小、病情及预后具有参考价值，hs-CRP激活补体成分是通过各种途径实现的，激活血管内皮细胞，增加血管紧张性[15]；同时可以激活纤溶系统，增强血小板聚集，上调内皮黏附因子，激活静止的内皮细胞，从而引起血栓形成[16]。本实验结果中假手术组的hs-CRP含量最低，模型组的含量最高，尼莫地平组的含量小于调脂通脉颗粒组，考虑到观察时间较短，不能很好地反应调脂通脉颗粒的长期预后;且调脂通脉组高剂量的hs-CRP含量低于中剂量组和低剂量组，说明高剂量组在抗炎效果方面优于中、低剂量组，可见高剂量组能较好地抑制炎症因子的释放。

脂蛋白相关磷脂酶(Lp-PLA2)是新型炎症指标，其别名是血小板活化因子乙酞水解酶(PAF-AH)，分子量为45 kDa，参与了动脉粥样硬化斑块形成和最终破裂的全过程，Lp-PLA2是T细胞分泌的，且此细胞只存在于血管内壁，Lp-PLA2高表达时说明了血管的炎症反应活跃[17]。研究表明，动脉粥样硬化(AS)的血管中，因自发地启动了ox-LDL的水解程序，脂质类促炎增多，加重AS的进展[18]。AS斑块和Lp-PLA2相互影响，脑梗死会刺激巨噬细胞、T细胞和肥大细胞分泌Lp-PLA2[19]，有研究表明Lp-PLA2可以作为脑梗死的独立危险因素[20]。本实验结果说明调脂通脉的抗炎作用与浓度有关，高剂量组的抗炎效果最好，模型组因未应用药物干预，Lp-PLA2的含量最高。模型组梗死体积最小，高剂量组次之，高剂量组的疗效优于中、低剂量组，说明其疗效与剂量相关。

脑梗死[21]见于“中风”“卒中”描述中，老年人多见，主要是由于老年人多年老体弱，正气不足，脏腑之气渐衰，精气渐减，脾气虚弱，无力健运水谷，积聚成痰湿，阻碍气血运行，留为瘀血，痰瘀互阻，阻滞脑络，发为中风[22]。在《灵枢·刺节真邪》篇中言：“虚邪偏客于身半，其人深，内居营卫，营卫稍衰，则真气去，邪气独留，发为偏枯”，认为正虚邪盛是其发病的主要病机[23-24]。而调脂通脉解毒方就是针对气虚痰瘀阻滞之缺血性脑卒中而设,以太子参、黄芪健脾益气，丹参、赤芍活血化瘀；佐以草决明、半夏燥湿化痰；泽泻利水祛痰；山楂消痰去积、活血祛瘀，全方益气活血化痰，使气虚得补，气血得运，血瘀得通，痰浊得化。临床研究表明，在益气化痰活血法指导下组方的调脂通脉颗粒，具有降低血脂异常患者血脂水平和改善患者血液流变性、改善血液黏、浓、聚、凝状态及凝血和纤溶系统功能的作用，具有一定的抗凝血、防止血栓形成、抗动脉硬化的功效[25]。调脂通脉解毒方在调脂通脉颗粒的基础上增加了土茯苓等解毒的药物，久病成瘀，久病成毒，符合王永炎院士提出“毒损脑络”的理论[26]，加用解毒清热的中药，增强其解毒的作用。

综上所述，调脂通脉解毒方可以减轻脑缺血再灌注的炎症反应，减轻脑缺血再灌注损伤，但效果在2周内不如尼莫地平明显，考虑可能为实验周期不够的原因，应加大样本量和观察周期。