柴达木黑果枸杞抗氧化物组分分析

王春雨，张志春，卢九斤，张 莹，孙丰豪，盛海彦

(1.青海大学 农牧学院，西宁 810016；2.青海省气象局，西宁 810016)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)属茄科(Solanaceae)枸杞属(LyciumL.)的多棘刺灌木，主要分布于西北干旱盐碱土荒漠地区。根据藏医药典《四部医典》《晶珠本草》的记载，黑果枸杞主治心热病、心脏病、月经不调、停经等[1]。现代医学研究也证明黑果枸杞具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力、降血糖、预防动脉粥样硬化等功效[2-5]。其良好的医用功效主要得益于果实中丰富的多酚、维生素E和黄酮等生物活性物质[6]。多酚能清除体内氧自由基，预防心脑血管疾病和抵抗机体老化[7]。维生素E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素，能减少有毒物质的产生，保护细胞结构的完整，可以起到护肤美容和增加机体免疫力的功能，是最主要的抗氧化剂之一[8]。黄酮类化合物具备抵抗氧化和降低血脂活性等特性[9-10]。

在青海柴达木盆地，黑果枸杞集中分布于格尔木、都兰、德令哈、乌兰等盆地中东部地区，能抗风固沙，是荒漠戈壁重要的建群植物[2,11]。研究表明，柴达木盆地所产黑果枸杞原花青素质量分数高于新疆中、北、南部，宁夏，甘肃及内蒙所产黑果枸杞，表现出道地性特征[12-13]。黑果枸杞是典型的集生态价值、营养价值和药用价值于一身的荒漠盐碱地区原生树种，对维持柴达木盆地生态平衡有重要意义，有极高的开发利用价值。

矫晓丽等[14]分析研究了青海可鲁克湖周边生长的野生黑果枸杞脂肪、多糖、总黄酮等营养成分质量分数；樊光辉等[8]分析了青海诺木洪地区人工栽培黑果枸杞氨基酸、维生素E、总黄酮等有效成分质量分数；刘桂英等[15]对比分析了青海诺木洪、格尔木、德令哈3个地区的野生黑果枸杞表型性状。前人在探索黑果枸杞特性方面做了大量工作，但研究涉及地区范围较小，相对柴达木盆地范围内野生黑果枸杞来说存在一定局限性，系统调查柴达木盆地野生黑果枸杞的抗氧化组分质量分数的研究鲜有报道。本试验测定了柴达木盆地野生黑果枸杞中多酚、总黄酮和维生素E质量分数，并对多酚和花青素组分构成做了初步探究，样地范围基本涵盖柴达木地区野生黑果枸杞典型分布区，以期为黑果枸杞优质品种的选育、栽培、质量评价及迅速开发利用积累科学数据和资料。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

柴达木盆地位于东经90.27～99.27°、北纬35.00～39.33°之间。柴达木盆地为阿尔金山、祁连山和昆仑山所环绕的不规则内陆山间断陷盆地，盆地西高东低，西宽东窄，略呈三角形，东西长约800 km，南北宽约300 km，面积 25.78×104km2，地势自西北向东南缓倾，海拔为2 600～ 3 000 m。盆地内土壤为灰棕漠土、盐土、风沙土、棕钙土和少量粗骨土，研究区域内主要为灰棕漠土和盐土。盆地属高原大陆性气候，以干旱为主要特征。本试验在柴达木盆地中东部野生黑果枸杞典型原生分布区上进行。

1.2 试验材料

黑果枸杞为2016年8月采摘于研究区内。每个采样点随机选择20～30株长势优良的植株，采摘成熟且大小均匀一致的鲜果1～2 kg，自然晾晒风干后，去除果蒂，粉碎过40目筛，-20 ℃保存待用。样品采集信息见表1。

主要试剂：盐酸(色谱纯，上海安谱公司)、甲醇(色谱纯，上海安谱公司)、没食子酸、福林酚试剂、去离子水、芦丁标准品、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、生育酚标准品。试剂除特殊注明外均为分析纯。

主要仪器：超声波清洗仪(KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司)、离心机(DIGICEN 21R，北京桑翌实验仪器)、紫外分光光度仪(TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司)、索氏提取仪(WSC-SXT-02，北京同德创业科技有限公司)、液相色谱—质谱联用仪(Q-Exactive，ThermoFisher)、高效液相色谱仪(L6-DP6，北京普析通用仪器有限责任公司)；色谱柱(Column Heater L6-C01，北京普析通用仪器有限责任公司)；在线脱气机(DG55-2，北京同德创业科技有限公司)。

表1 样品采集信息表Table 1 Information table of sample collection

1.3 试验方法

1.3.1 多酚质量分数测定 利用超声辅助法提取黑果枸杞多酚[16]；利用福林酚法测定总酚质量分数[17]；利用超高效液相色谱—串联四级杆质谱技术对多酚进行分离鉴定[18]，略做改动。

仪器条件为色谱系统：Dionex Ultimate 3000 RSLC；色谱柱：Hypersil GOLD aQ，100 mm× 2.1 mm，1.9 μm；流动相：A：0.9%乙酸水溶液；B：甲醇(色谱纯)；进样量： 3 μL；流速：0.3 μL·min-1；质谱系统：Thermo Q-Exactive。以没食子酸为标准物质所得标准曲线回归方程为y=2.156x+1.149 1(R2=0.990 5)。

1.3.2 总黄酮质量分数测定 利用有机溶剂法提取黑果枸杞总黄酮；利用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定黑果枸杞中总黄酮的质量分数[19]，以芦丁为标准物质所得标准曲线回归方程为y=233.6x-0.353 3(R2=0.999 2)。

1.3.3 维生素E质量分数测定 维生素E的提取与测定方法参考刘红河等[20]的反相高效液相色谱—二极管阵列检测法(HPLC-DAD)，略作 改动。

仪器条件为流动相甲醇(分析纯)∶乙腈(分析纯)= 93∶7，流速1.0 mL·min-1，柱温 30 ℃， 280 nm波长扫描。以生育酚为标准物质所得标准曲线回归方程为y= 1.787 4e-0.04x+1.258 4(R2=0.994 4)。

1.3.4 花青素鉴定及半定量分析 测定方法为UPLC-MS-MS[21]，略做改动。

用1%盐酸—甲醇溶液反复提取粉粹样品中的花青素，提取液过0.22 μm滤膜，用ThermoFisher Q-Exactive LC-MS/MS对样品提取液进行测定分析。

仪器条件为色谱柱C18(100×4.6 mm)；二元流动相分别为A相： 0.9%乙酸水溶液，B相： 0.9%乙酸乙腈溶液；梯度洗脱条件如下：柱温 30 ℃；流速0.3 mL·min-1；0～5 min，A相从97%降至90%；5～10 min，A相降至70%；10～15 min，A相降至60%；15～20 min，A相降至20%；25～25 min， A相提升至97%；27～30 min，A相保持97%。

1.4 数据分析

采用Excel 2010进行数据整理和绘制图表，均以“平均值±标准误”表示数据。采用DPS 7.05软件中Duncan新复极差法进行显著性 分析。

2 结果与分析

2.1 黑果枸杞总多酚、总黄酮和维生素E质量分数

由表2可知，所检测的12个样品中总多酚质量分数为(8.19±0.50)～(28.60±0.54) mg·g-1，平均质量分数为17.92 mg·g-1，不同样品间质量分数差异极显著(P<0.01)。其中GEM2与MH总多酚质量分数极显著高于其他样品；NMH1极显著低于其他样品；DCD显著高于DLH2，DLH2又显著高于DGL；DLH2>ZJ>DLH1>GEM1>NMH2>WTMR，但未达显著水平。总多酚质量分数格尔木、诺木洪地区栽培型高于野生型，德令哈地区栽培型与野生型质量分数相当。与闫亚美等[16]测得黑果枸杞多酚质量分数为8.25～87.77 mg·g-1的结果相似。

总黄酮的质量分数为(1.63±0.10)%～ (3.15±0.16)%，平均质量分数为2.39%，不同样品间质量分数存在极显著差异(P<0.01)。其中DCD、WTMR、GEM1、BKL、MH质量分数相对较高；DGL、DLH1、DLH2、NMH1总黄酮质量分数显著低于其他地区(P<0.05)。总黄酮质量分数格尔木和德令哈地区栽培型与野生型差异不显著，诺木洪地区栽培型质量分数显著高于野生型。与李兆君等[19]利用分光光度法测得宁夏黑果枸杞的总黄酮质量分数为2.71%的结果相似。

维生素E的质量分数为(0.08±0.01)～ (0.96±0.02) mg·g-1，平均质量分数为0.51 mg·g-1，不同样品间质量分数存在极显著差异(P<0.01)。其中，DGL维生素E质量分数极显著高于其他样品；DLH1与DLH2极显著低于其他样品；BKL>GEM1>GEM2但未达显著水平；GEM2显著高于DCD，DCD>ZJ但未达显著水平；ZJ显著高于NMH1，NMH1>NMH2但未达显著水平；WTMR质量分数低于NMH2但未达显著水平，但显著低于NMH1。维生素E质量分数野生型与栽培型不存在显著差异。与王琴[22]测得新疆黑果枸杞维生素E质量分数为0.46 mg·g-1的结果相似。

表2 黑果枸杞总多酚、总黄酮和维生素E质量分数Table 2 Contents of total polyphenols、total flavonoids and vitamin E in Lycium ruthenicum murr

注：不同小写字母表示在0.05水平存在显著差异，不同大写字母表示在0.01水平存在显著差异；1表示野生型，2表示栽培型；下同。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level,and different uppercase letters indicate significant difference at 0.01 level; 1 means wild type,2 means cultivated type; the same below.

2.2 黑果枸杞多酚类物质(非花青素)的分离 鉴定

采用反相高效液相色谱—二极管阵列检测法，在黑果枸杞中利用标准品对儿茶素、绿原酸、咖啡酸、鞣花酸、阿魏酸、没食子酸、橙皮苷、山奈酚、柚皮素、柚皮甙、OPC-A2、OPC-B2、对香豆酸、根皮素、原儿茶酸、槲皮素、丁香、香草酸共18种多酚类物质进行了分离鉴定。由表3可知，其中咖啡酸、山奈酚、柚皮素、对香豆酸、槲皮素被最终检测并定量。咖啡酸质量分数变幅为(1.31±0.03)～(11.99±0.32) mg·kg-1，马海质量分数最高，诺木洪人工栽培质量分数最低。山奈酚质量分数变幅为(1.44±0.01)～(6.31±0.09) mg·kg-1，大柴旦最高，大格勒最低。柚皮素质量分数为(18.7±1.72)～(101.22±1.60) mg·kg-1，大柴旦最高，德令哈人工栽培最低。槲皮素质量分数乌图美仁最高，大格勒最低，整体变幅为(55.33±2.50)～(131.83±2.21) mg·kg-1。供试的12个样品中均含有咖啡酸、山奈酚、柚皮素和槲皮素，其中9个样品中均检测到了对香豆酸的存在，但DCD、DLH1、WTMR未检出。推测可能是地理差异、遗传差异等因素造成了不同样品之间多酚组分构成不同，具体原因有待进一步研究探明。

表3 黑果枸杞多酚各组分质量分数Table 3 Content of each component of polyphenols in Lycium ruthenicum murr

2.3 黑果枸杞花青素类物质分离鉴定

如表4、图1所示，检测结果表明，柴达木黑果枸杞花青素母核主要有4种，分别是矮牵牛素(m/z317)、飞燕草素(m/z303)、锦葵素(m/z331)和矢车菊素(m/z287)。

黑枸杞花青素主要由这4种母核键合糖苷等物质衍生而来，在供试样品中共发现12种花青素类化合物。其二级质谱碎片大多是由母核离子失去糖基而得到，因此具有一定的特征。通过对母核离子以及碎片的特征信息进行分析鉴定，并结合文献资料，对其中10 种花青素类化合物进行了命名，结果如表5所示。

表4 黑果枸杞主要花青素母核Table 4 Main anthocyanin core of Lycium ruthenicum murr

图1 黑果枸杞花青素母核结构式Fig.1 Structural formula of anthocyanin mother core of Lycium ruthenicum murr

表5 黑果枸杞花青素信息Table 5 Athocyanins extract of Lycium ruthenicum murr

12种花青素类化合物相对质量分数在不同样品间有所变化(表6)。结果表明矮牵牛素-3-O-顺式香豆酰芸香糖-5-O-葡萄糖苷(或矮牵牛素-3-O-反式香豆酰芸香糖-5-O-葡萄糖苷)是柴达木野生黑果枸杞花青素的主要成分，占花青素总量的 49.42%～79.13%。但马海地区(MH)黑果枸杞矮牵牛素-3-O-对香豆酸-槐糖苷-5-O-葡萄糖苷占总花青素的40.00%，较矮牵牛素-3-O-香豆酰芸香糖-5-O-葡萄糖苷高1.62%。总的来说不同采集点黑果枸杞花青素总体组成模式基本相同，但个体之间各类母核离子质量分数及各花青素浓度不同，造成这一差异的原因可能是地理、气候环境、地球化学元素以及遗传等多因素共同作用的结果，有待进一步深入研究。

表6 黑果枸杞各花青素的相对质量分数Table 6 Relative content of each anthocyanin in Lycium ruthenicum murr %

3 讨论与结论

果实中营养物质质量分数的高低往往决定了果实品质的好坏，果实中营养物质的质量分数可以作为评价果实质量的依据和参考[28]。总多酚、总黄酮、维生素E是重要抗氧化物质组分。有研究表明，红果枸杞的总多酚、总黄酮和维生素E质量分数分别为2.43 mg·g-1、1.67%和0.11 mg·g-1[29-30]，黑果枸杞总多酚、总黄酮和维生素E的平均质量分数分别为17.92 mg·g-1、 2.39%和0.51 mg·g-1，是红枸杞质量分数的 7.37倍、1.43倍和4.54倍，黑果枸杞营养价值明显优于红果枸杞。菲尔杜德和宝石红两个品种的红树莓总多酚质量分数分别为3.74 mg·g-1和2.87 mg·g-1[31]，供试黑果枸杞的总多酚质量分数平均达17.92 mg·g-1，明显高于红树莓。

德令哈、格尔木、诺木洪地区野生黑果枸杞的总多酚质量分数分别为14.61 mg·g-1、15.20 mg·g-1、8.19 mg·g-1，人工栽培黑果枸杞多酚质量分数分别为17.70 mg·g-1、28.60 mg·g-1、16.14 mg·g-1；德令哈、格尔木、诺木洪地区野生黑果枸杞总黄酮质量分数分别为 1.84%、2.85%、1.63%，人工栽培黑果枸杞总黄酮质量分数分别为1.78%、2.44%、2.34%；德令哈、格尔木、诺木洪地区野生黑果枸杞维生素E质量分数分别为0.10 mg·g-1、0.71mg·g-1、0.36 mg·g-1，人工栽培黑果枸杞维生素E质量分数分别为0.08 mg·g-1、0.65 mg·g-1、0.32 mg·g-1。人工栽培与野生黑果枸杞营养成分质量分数相当或人工栽培质量分数较野生黑果枸杞显著提升，说明人工栽培不会影响黑果枸杞营养品质，且生长环境良性改变有助于黑果枸杞营养物质的积累。这一发现与祁银燕等[32]研究结果一致。

本研究发现矮牵牛素(m/z317)、飞燕草素(m/z303)、锦葵素(m/z331)和矢车菊素 (m/z287)是柴达木黑果枸杞花青素的主要母核物质，其果实中所含花青素主要由这4种母核物质键合糖苷等衍生而来。前人研究认为黑果枸杞不含有矢车菊素衍生物[24]，本研究发现矢车菊素也是黑果枸杞花青素的主要母核物质，补充了前人研究结果。吕玉姣等[33]在新疆库尔勒地区黑果枸杞中发现了天竺葵素衍生物，而在本研究中未检测到，推测可能是地理因素导致的这一差异。在柴达木黑果枸杞中共发现12种花青素类化合物，并对其中10种进行命名。不同地区黑果枸杞多酚和花青素的构成模式基本相同，但各组分的质量分数、占比均不同，具体原因有待进一步研究。本试验供试样品基本覆盖了柴达木盆地黑果枸杞资源类型，研究结果对柴达木盆地黑果枸杞资源的人工选育和栽培提供了数据基础和理论 指导。