三种固定剂对氯化金染色大鼠运动终板效果的比较

李良奎 刘茂生 习亚州 彭艳春 徐秋霞 黄鑫 顾银中

[摘要] 目的 對比分析25%甲酸、25%乙酸和4%甲醛3种固定剂对氯化金染色运动终板的效果。 方法 选用30只SD大鼠，体重180～220 g，雌雄不拘。进行10次实验，每次实验随机选取3只，取右侧肱二头肌，分别置于25%甲酸、25%乙酸和4%甲醛溶液中固定后，行氯化金镀金法，光学显微镜下观察运动终板的形态结构和背景颜色。结果 3种固定剂固定的运动终板边缘整齐，中央颜色浅于周围，部分运动终板中央呈空泡状。甲酸固定的肌纤维排列有序，横纹清晰，呈紫红色;乙酸固定的肌纤维排列有序，无清晰的横纹，呈紫蓝色，但染色较浅，与运动终板形成的反差较小;甲醛固定的肌纤维排列杂乱，无横纹，呈紫红色、粉红色、紫黑色和蓝色等多种颜色。 结论 甲酸固定的运动终板氯化金染色效果优于乙酸和甲醛，甲酸固定的肌组织需要的还原时间少于乙酸和甲醛。因此，进行运动终板染色选择固定剂时，25%甲酸在3种固定试剂中可作为最佳选择。

[关键词] 固定剂;运动终板;肱二头肌;镀金法

[中图分类号] R322          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）08-0031-03

Comparison of the effects of three fixatives on gold chloride-stained rats

LI Liangkui   LIU Maosheng   XI Yazhou   PENG Yanchun   XU Qiuxia   HUANG Xin   GU Yinzhong

Department of Human Anatomy， Zhuhai Campus， Zunyi Medical University， Zhuhai   519041， China

[Abstract] Objective To compare and analyze the effects of 25% formic acid， 25% acetic acid and 4% formaldehyde on gold chloride-stained sports endplates. Methods Thirty SD rats weighing 180-220 g were selected. 10 experiments were performed. 3 experiments were randomly selected for each experiment. The right biceps were taken and fixed in 25% formic acid， 25% acetic acid and 4% formaldehyde solution respectively， and then treated with gold chloride-stained method. The morphology and background color of the sports endplates were observed under an optical microscope. Results The edges of the sports endplates fixed by the three fixatives were neat and the center was lighter in color than the surroundings. Some of the sports endplates were hollow in the center. Formic acid-fixed muscle fibers were arranged in an orderly manner with clear stripes and purple-red. Acetic acid-fixed muscle fibers were arranged in an orderly manner without clear stripes and were purple-blue in color， but the staining was lighter and the contrast with the motor endplates was small. The formaldehyde-fixed muscle fibers were arranged in a disorderly manner， without stripes， and had a variety of colors such as magenta， pink， purple black， and blue. Conclusion The gold chloride staining effect of formic acid-fixed sports endplates is better than that of acetic acid and formaldehyde， and the reduction time of formic acid-fixed muscle tissue is less than that of acetic acid and formaldehyde. Therefore， 25% formic acid can be the best choice among the 3 kinds of fixatives when selecting the fixatives for sports endplate staining.

[Key words] Fixative; Motor endplates; Biceps bram; Gold plating

运动终板是神经支配骨骼肌运动的特化结构[1]，其功能是将神经发出来的电信号传递到骨骼肌内，支配骨骼肌的伸缩运动[2-3]，骨骼肌运动依赖于完整的运动终板。当今社会，各类意外事故和地质灾害直接或间接地导致受伤人员周围神经不同程度的损伤，进而导致运动终板的退化和肌肉的萎缩[4-7]。运动终板染色能显示周围神经损伤和修复过程中运动终板的数目和形态，从而判断其退行性变的程度和再生重建的效果，而运动终板染色的质量将直接影响到对周围神经损伤和修复程度的评估。氯化金镀金染色是显示运动终板的常用方法，其步骤分为取材、固定、染色、还原、软化和镜检。在染色过程中，选择不同固定试剂对染色效果有着显著影响。现代研究中常用的固定剂有25%甲酸、25%乙酸和4%甲醛[8-10]，这3种固定试剂均存在各自的优缺点[11-12]，且在运动终板染色中，由于缺乏相关文献对其进行对比分析的报道，故本研究选择这3种固定剂为研究对象，对比分析3种固定剂对氯化金染色運动终板的效果，从而筛选出最佳的固定剂，为进行运动终板染色选择固定剂提供实验参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

甲酸（天津市富宇精细化工有限公司，分析纯，批号：20180102）、冰乙酸（天津市大茂化学试剂厂，分析纯，批号：20180103）、甲醛（天津市大茂化学试剂厂，分析纯，批号：20180301）、丙三醇（天津市大茂化学试剂厂，分析纯，批号：20180115）、氯化金（天津市迈斯科化工有限公司，分析纯）、显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）。

1.2 实验动物

SD大鼠，30只，体重180～220 g，雌雄不拘，由广东省医学实验动物中心[实验动物许可证号：SCXK（粤）2018-0002]提供。

1.3 方法

1.3.1 试剂配制  将氯化金溶于PBS溶液，配制成1%氯化金溶液;甲酸、乙酸和甲醛用纯净水分别配制成25%甲酸、25%乙酸和4%甲醛的固定试剂。

1.3.2 取材  进行10次实验，每次实验随机选取3只SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，将其固定于鼠手术板上，取右侧肱二头肌，剥离肱二头肌周围的结缔组织，生理盐水洗净肱二头肌。

1.3.3 固定  将3块肱二头肌分别放入50 mL25%甲酸、25%乙酸和4%甲醛溶液中固定35 min，待肌组织呈半透明状态时，取出肌组织用蒸馏水洗净固定液，滤纸吸干水分。

1.3.4 染色  固定后的组织放入1%氯化金中染色100 min（避光），取出肌组织用蒸馏水漂洗后，再用滤纸吸干。

1.3.5 还原  染色后的肌组织放入50 mL 25%甲酸溶液中进行还原，甲酸、乙酸和甲醛固定的肌组织还原时间分别为24 h、32 h和69 h，还原至肌组织中央呈紫红色、周围呈暗褐色。取出肌组织用自来水反复清洗，然后用蒸馏水漂洗数次，以彻底洗净还原液，再用滤纸吸干多余水分。

1.3.6 软化  还原后的肌组织放入丙三醇软化6～12 h。

1.3.7 镜检  从丙三醇中取出肌组织，用滤纸吸掉表面的丙三醇，顺着肌纤维的方向切取大小为1 mm×1 mm×4 mm肌组织于载玻片上，滴加1滴中性树胶，盖上盖玻片并轻压盖玻片，使肌纤维分散开，在光学显微镜下寻找并观察运动终板。压片时切忌用力过大，避免损坏运动终板。有研究报道[13]，采用双盖法封片，有利于标本的保存。

2 结果

2.1 三种固定试剂固定肌组织肉眼观及一般情况

氯化金染色实验的不同阶段，3种固定剂固定的肌组织、肉眼观及一般情况不尽相同。在固定、染色后，肌组织外观相似;还原后的肌组织外观各有其特点，还原时间相差较大，肌组织柔韧度和压片情况也存在差异。见表1。

2.2 运动终板与肌纤维镜下观

神经和运动终板被氯化金染成黑色，神经末梢像“爪”样附着于肌纤维上，与肌纤维连接处膨大呈椭圆形或球形，此即运动终板。3种固定剂固定的运动终板边缘整齐，中央颜色浅于周围，部分运动终板中央呈空泡状。甲酸固定的肌纤维排列有序，横纹清晰，呈紫红色（封三图1～2）;乙酸固定的肌纤维排列有序，无清晰的横纹，呈紫蓝色，但染色较浅，与运动终板形成的反差较小（封三图3～4）;甲醛固定运动终板较模糊，肌纤维排列杂乱，无横纹，呈紫红色、粉红色、紫黑色和蓝色等多种颜色（封三图5～6）。

3 讨论

在运动终板染色中，3种固定剂固定的肌组织所需要的还原时间相关文献报道较少，因此，为了确定它们的最佳还原时间，在进行本实验之前，以还原时间为自变量额外增加一组实验进行探索，通过对比分析运动终板的清晰度和背景颜色，最终明确，经甲酸、乙酸和甲醛固定的肌组织需要的最佳还原时间分别为24 h、32 h和69 h。本研究发现，乙酸还原时间不足，背景颜色太黑，显微镜下无法寻找和观察运动终板;甲醛还原时间过长，背景颜色太红，运动终板显示不清。本研究说明，在同等条件下，进行运动终板染色选用甲酸固定剂能节约大量时间。

在本研究中，甲醛固定的肌组织、神经和运动终板较模糊，肌纤维呈现多种颜色，出现这种改变可能与甲醛的物理和化学性质有关，经甲醛固定的肌组织会使肌组织缩小和变韧，这可能造成氯化金未能均匀、快速地浸入肌组织进行染色。此外，甲醛水溶液的弱酸性pH值会达到某些蛋白质的等电点水平[14]，蛋白质在等电点时稳定性最差，易与甲醛发生多种化学反应，从而改变肌组织原来的结构，使染色性质改变。甲醛的这些性质，可能会影响氯化金对肌组织的染色效果，进而影响运动终板的观察结果。

本研究显示，三种固定剂固定的运动终板均有中央浅染，甚至中央呈空泡状的现象，其原因可能与固定剂溶液的酸性有关。有关文献报道[15]，酸性固定剂会使细胞内含物溶解，这可能是甲酸、乙酸固定运动终板形成空泡状的原因。而甲醛分子结构中含有碳氧双键，化学性质活泼，在水溶液中易发生Cannizzaro反应生成甲酸[14]，这可能是甲醛固定运动终板也形成空泡状的原因。此现象可能会影响对运功终板原始形态结构的观察。

综上所述，甲酸固定的运动终板氯化金染色效果优于乙酸和甲醛，且在还原时间上，甲酸固定的肌组织需要的还原时间少于乙酸和甲醛。不足之处在于3种固定剂固定的运动终板均有中央浅染，甚至中央呈空泡状的现象，这可能会影响观察运动终板的原始形态结构。总之，甲酸固定的运动终板在效果和还原时间上均优于乙酸和甲醛。因此，在观察运动终板形态结构进行氯化金染色时，25%甲酸在三种固定试剂中可作为最佳选择。

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（收稿日期：2019-10-24）