液液萃取-HPLC法测定食品中黄曲霉毒素B1

马海峰，陶唐平，方林明，刘成林，单平平，陈辉德*

安徽中创食品检测有限公司（芜湖 241000）

黄曲霉毒素是一类由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的代谢产物，目前发现的有20余种，确定结构的有17种[1-2]。黄曲霉毒素极易污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米及大米等，在众多黄曲霉毒素中以黄曲霉毒素B1分布最为广泛，并且是毒性最强的一种，被确认为I类致癌物[3-7]。多数国家非常重视黄曲霉毒素B1防控，并制定食品中黄曲霉毒素B1的限量标准[8-11]。

食品中黄曲霉毒素B1常用的检测方法有薄层色谱（TLC）法、酶联免疫（ELISA）法、高效液相色谱（HPLC）法及液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）法[12-20]等。TLC是检测黄曲霉毒素B1的经典方法，但前处理繁琐，易受杂质干扰并且定量起来较为困难。ELISA法检测过程比较简便，但有可能产生假阳性或假阴性结果，检测准确度有待提高。HPLC-MS法检测结果准确，检出限低，但仪器价格昂贵，不易普及。因此通常采用HPLC法测定黄曲霉毒素B1。

HPLC法测定黄曲霉毒素B1过程中，为了排除提取液中的杂质对分离和检测干扰，需要采用免疫亲和柱[19-20]或专用固相萃取柱[21]净化，成本较高。试验基于液液萃取对提取液进行净化，并考察流动相组成和提取溶剂比例对结果的影响，验证不同基质的加标回收率和精密度；建立一种操作方便，灵敏度好，准确性高的黄曲霉毒素B1高效液相色谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

液相色谱仪配荧光检测器（LC-20A，SHIMADZU）；电子分析天平（ME-204，METTLER TOLEDO）；超声波清洗机（KQ-800DE，昆山市超声仪器有限公司）；涡旋混合器（Lab dancer，IKA）；氮吹仪（N1，上海屹尧科技有限公司）；均质器（T25，IKA）；超纯水机（Milli-Q，Millipore）；高速离心机（TDZ5-WS，湘仪离心机仪器有限公司）；有机系滤头（0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司）。

甲醇、乙腈、三氯甲烷、正己烷（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；黄曲霉毒素B1标准储备溶液（3 μg/mL，美国o2si标准品公司）；亚铁氰化钾、乙酸锌、碘（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；流动相用水（GB/T 6682规定的一级水）。

1.2 黄曲霉毒素B1标准系列工作溶液的配制

用初始流动相将黄曲霉毒素B1标准溶液逐级稀释，最终得到0.1，0.5，2.5，5.0，10.0，25.0和50.0 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准系列工作溶液。

1.3 色谱条件

Shim-pack GIST C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-水（15∶20∶65，体积比）；流速1.0 mL/min；柱温40 ℃；进样量50 μL；柱后衍生系统（衍生溶液，0.05%碘溶液；衍生溶液流速0.2 mL/min；衍生反应管温度70 ℃）；荧光检测器（激发波长360 nm，发射波长440 nm）。

1.4 样品的预处理

1.4.1 提取

准确称取5 g左右试样于50 mL塑料离心管中，加入10.0 mL乙腈-水（85∶15，V/V）混合提取液，涡旋混匀1 min后，水浴超声30 min。冷却至室温后，加入2 mL亚铁氰化钾溶液（92 g/L）和2 mL乙酸锌溶液（183 g/L），混匀后静置10 min。于离心机中以5 000 r/min离心10 min，上清液转移至25 mL容量瓶中。于残渣中加入5.0 mL上述提取液，重复提取1次，合并2次提取液于同一25 mL容量瓶中，并定容至刻度。（液体样品直接加乙腈定容至25 mL）。

1.4.2 净化与浓缩

准确吸取5.0 mL上清液，加入5 mL正己烷，涡旋2 min后弃去上层溶液（如产生乳化现象，可于离心机中4 000 r/min离心5 min）。于上述溶液中加入5 mL三氯甲烷，充分涡旋3 min，以5 000 r/min离心10 min，将三氯甲烷层转移到另一离心管中。重复萃取1次，合并2次萃取液于60 ℃水浴中氮吹至干。用初始流动相复溶并定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜后以备测定。

1.4.3 测定

将净化后的样液注入液相色谱仪中，在与标准系列工作液相同的仪器条件下测定峰面积，根据外标法比较定量。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

采用的净化方式是液液萃取，相比于免疫亲和柱或专用固相萃取柱来说，液液萃取净化法得到的净化液中可能会残留一些杂质，从而对检测造成干扰[22-23]。为满足实际检测需求，通过考察甲醇、乙腈与水之间不同比例组成，并结合检测效率最终确定以甲醇-乙腈-水（15∶20∶65，体积比）作为流动相，等度洗脱且流速设置为1.0 mL/min。图1为此流动相条件下的黄曲霉毒素B1标准系列工作液色谱图。

图1 黄曲霉毒素B1标准系列工作液色谱图

2.2 标准曲线及方法检出限

将1.2中的黄曲霉毒素B1标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪进行测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图2。在0.1～50 ng/mL质量浓度范围内，峰面积与浓度呈现良好线性关系，线性回归方程为y=74 178.3x-7 972.1，拟合系数为0.999 97。以3倍信噪比（S/N=3）计算仪器检出限，结合检测前处理过程计算黄曲霉毒素B1的方法检出限为0.02 μg/kg。

图2 黄曲霉毒素B1标准曲线

2.3 样品的前处理探究

2.3.1 提取溶剂的选择

黄曲霉毒素B1易溶于甲醇、乙腈和三氯甲烷等溶剂，通常采用含有一定比例甲醇或乙腈水溶液提取样品中的黄曲霉毒素B1。以空白花生样品为基质（加标量20 μg/kg），选用乙腈-水作为提取溶剂，分别探究不同比例的乙腈-水（90∶10，85∶15，80∶20，75∶25，70∶30，60∶40和50∶50，体积比）对目标物提取率的影响，结果见图3。乙腈与水体积比85∶15时，提取率最高为85.6%。

图3 不同比例的乙腈-水提取液对花生样品中黄曲霉毒素B1的提取率比较

2.3.2 净化方式的选择

提取液中黄曲霉毒素B1常用的净化方法有免疫亲和柱法[19-20]，专用固相萃取柱法[21]和液液分配法[22-23]等。前两者虽净化效果优越，但耗时长，价格高，有一定局限性。因此试验采用液液分配法进行净化，在提取液中加入亚铁氰化钾和乙酸锌除去蛋白质，加入正己烷进行涡旋，分离脂溶性杂质。在样液中添加三氯甲烷进行目标物的萃取，浓缩、定容，采用柱后碘衍生-高效液相色谱荧光检测器进行检测。从图4可以看出，色谱图背景干净，花生样品本底无目标峰，加标样中目标峰与杂峰分离明显，说明液液萃取有较好的净化作用。液液分配法可以净化的特点主要有：提取液中加入蛋白沉淀剂可以除去提取液中的蛋白质；黄曲霉毒素B1难溶于正己烷，利用这一特性可以加入正己烷除去脂溶性杂质；黄曲霉毒素B1易溶于三氯甲烷，加入三氯甲烷后利用分配系数的差异将目标物转移到三氯甲烷中，起到进一步净化作用。

图4 花生空白样品及加标样品色谱图

2.3.3 加标回收试验及精密度测定

取花生、玉米、黄豆、大豆油、酱油、腐乳、辣椒、婴幼儿米粉等不同基质的样品，分别加入低（0.4 μg/kg）、中（4.0 μg/kg）、高（40 μg/kg）浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液，并按上述方法检测，各基质样品中的黄曲霉毒素B1的加标回收率结果见表1。由表1可得，所选的样品本底中黄曲霉毒素B1都未检出；加标量0.4，4.0和40 μg/kg时，回收率范围分别为75.9%～89.6%，78.5%～90.4%和82.1%～94.7%；每个加标量的相对标准偏差（RSD，n=6）分别为1.1%～5.4%，0.5%～5.2%和0.1%～1.8%。由此可见，该方法检测的准确性和重复性良好，能满足分析测试要求。

表1 不同基质中加标回收率和精密度分析（n=6）

3 结论

试验建立一种简单快速的测定食品中黄曲霉毒素B1方法，样品提取液经液液萃取净化、浓缩及定容后，用柱后碘衍生-高效液相色谱检测。利用该法对花生、玉米及黄豆等8种样品进行验证，结果证明方法无明显杂质干扰，并且准确性和重复性良好。此方法与传统高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1相比，操作方便，灵敏度好，准确性高，成本低廉，可推广用于食品中黄曲霉毒素B1检测。