超声波协同复合酶法提取圣女果皂苷工艺优化

辛明 ，孙宇，李昌宝 *，唐雅园，孙健 *，何雪梅

1. 广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所（南宁 530007）；2. 广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室（南宁 530007）

圣女果（Lycopersicon esculentumMill.）又称迷你番茄、小番茄等，属茄科番茄属植物，主要作为水果食用，被联合国粮农组织列为优先推广的“四大水果”之一[1-3]。圣女果富含维生素、矿物质、有机酸等营养成分，还含有谷胱甘肽、番茄红素等抗癌物质[4-5]。圣女果中主要的营养成分就是番茄红素，而番茄皂苷则是圣女果中除了番茄红素之外的主要有效成分[6-7]。番茄皂苷具有一般皂苷的性质，如降血脂、降胆固醇、抗动脉硬化、抗氧化、抑制癌细胞增殖等生理活性[8-10]。皂苷类物质是近年来研究的热点，不少研究者报道了皂苷的提取工艺，如人参[11]、罗汉果[12]、浆果[13]、苦瓜[14]等。令狐晨等[15]总结概括了水提法、超声提取法、酶提法、微波辅助提取，闪式提取等9种皂苷提取方法。目前国内只有少数番茄皂苷提取方面的报道：刘金磊等[16]运用果胶酶提取番茄总皂苷，并申请了专利；卢凤来等[17-18]主要研究用D101大孔树脂分离纯化番茄总皂苷并建立了番茄皂苷A的含量测定方法。而超声波协同复合酶法提取圣女果皂苷却鲜见研究报道。

超声波协同复合酶法能有效避免常规水提法的缺陷，超声波是利用其空化作用、机械效应及机械剪切作用对原料进行破碎，使胞内的有效成分扩散、溶出[19]；酶则具有水解纤维素的作用，促进胞内有效成分的溶出[20]。试验采用超声波协同复合酶法提取圣女果皂苷，开发完善皂苷提取工艺，以充分发挥其在保健食品、药品等方面的可利用性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜圣女果，2018年3月采于广西百色市田阳县百育镇圣女果种植基地，选取无病虫害、无腐烂损伤的果实；香草醛、硫酸、无水乙醇、甲醇、磷酸二氢钠、二水合柠檬酸三钠均为分析纯；人参皂苷Rh1标准品（Singma公司）；纤维素酶、果胶酶为食品级。

Genesys 10s UV-Vis紫外可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific）；HH-S4数显恒温水浴锅（金坛市万华实验仪器厂）；ATX124精密电子天平（SHIMADZU）；PHS-3C pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；3K15高速低温离心机（SIGMA）；Vortex-Genie 2涡旋振荡器（Scientific Industrie）；A3000榨汁机（南京威利郎食品有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 不同皂苷的提取方法

1.2.1.1 皂苷提取工艺流程

新鲜圣女果→清洗→打碎成浆→不同方法提取→过滤→收集上清液→皂苷含量测定

1.2.1.2 不同方法提取

水提法：称取100 g圣女果，洗净后打碎成浆，加入蒸馏水调整料液比至1∶10（g/mL），于80 ℃加热浸提2 h，用80～100目滤布过滤，所得滤液以4 500 r/min离心10 min，收集上清液，测定皂苷含量。

酶提法[21-22]：称取100 g圣女果，洗净后打碎成浆，加入0.05%的酶（果胶酶与纤维素酶质量比1∶2），加入蒸馏水调整料液比至1∶10（g/mL），在50℃下保温酶解2 h，灭酶10 min。酶解液用80～100目滤布过滤，所得滤液以4 500 r/min离心10 min，收集上清液，测定皂苷含量。

醇提法：称取100 g圣女果，洗净后打碎成浆，加入75%的乙醇溶液调整料液比至1∶10（g/mL），于60 ℃水浴锅中提取2 h。用80～100目滤布过滤，所得滤液以4 500 r/min离心10 min，收集上清液，测定皂苷含量。

超声波协同酶法：称取100 g圣女果，洗净后打碎成浆，加入0.05%的酶（果胶酶与纤维素酶质量比1∶2），加入蒸馏水调整料液比至1∶10（g/mL），在50℃下保温酶解2 h，再用功率210 W的超声波细胞破碎仪处理20 min时间，灭酶10 min。用80～100目滤布过滤，所得滤液以4 500 r/min离心10 min，收集上清液，测定皂苷含量。

1.2.2 皂苷含量测定

参考高凯翔等[23]的方法略修改，采用香草醛-硫酸法测定。取0.5 mL样品提取液于试管中，加入3.5 mL的香草醛-硫酸溶液，充分摇匀，将试管置于60 ℃水浴加热15 min，再置于冷水冷却10 min，以试剂空白为参比，在535 nm处测定其吸光度A，根据人参皂苷标准曲线计算出圣女果总皂苷含量。

标准曲线的绘制：精密称取人参皂苷标准品，以甲醇定容，配成质量浓度为15 g/mL的标准液。精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL标准液于试管中，加入3.5 mL的香草醛-硫酸溶液，充分摇匀，将试管置于60 ℃水浴加热15 min，再置于冷水冷却10 min，以试剂空白为参比，在535 nm处测定吸光度A，以人参皂苷Rh1的浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制人参皂苷Rh1的标准曲线，得到回归方程：y=0.052 4x-0.137 3（R2=0.995）。

1.2.3 皂苷提取率的计算

式中：m为圣女果质量，g；c为由标准曲线算得的皂苷质量浓度，μg/mL；N为稀释倍数；V为提取液总体积，mL。

1.2.4 单因素试验

以蒸馏水为提取溶剂，酶解温度50 ℃，超声功率210 W，依次固定料液比1∶40（g/mL）、酶浓度0.2%、酶解时间2.0 h、超声时间40 min，分别考察不同料液比（1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶80和1∶100 g/mL）、酶浓度（0.01%，0.05%，0.1%，0.2%和0.3%）、酶解时间（0.5，1，1.5，2和3 h）、超声时间（10，20，30，40，50和60 min）对圣女果皂苷提取率的影响，各试验重复3次。

1.2.5 正交试验设计

在单因素试验的基础上，以提取率为指标，按L9(34)正交表做正交试验，因素水平设计见表1，以确定超声波协同复合酶法提取圣女果皂苷的最佳工艺。

表1 正交试验水平因素表

1.2.6 数据处理

所有数据为3次以上重复试验的平均值±标准差；使用SPSS 19.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对圣女果皂苷提取率的影响

由图1可知，不同提取方法得到的圣女果皂苷提取率不同，最高为超声波协同酶法，其次为酶提法、水提法、醇提法。醇提法的提取率最低，醇提法所用提取溶剂为乙醇，其他方法均使用蒸馏水作为提取溶剂，表明圣女果中所含主要为水溶性番茄皂苷[7]。以水为溶剂提取圣女果皂苷能有效提高提取率，成本低、安全、环保，适合工业化生产。酶提法比水提法高，其原因是酶能加快生物的反应速度，破坏植物的细胞壁，使有效成分溶解出；而在正常情况下，水不易破坏植物的细胞壁，所以水提法较低[24]。超声波协同酶法提取率高，其原因是超声有破壁、振动、搅拌等功能，能提高反应速度，所以提取率增高[25]。而超声波协同复合酶法的提取率均高于其他方法，表明超声波协同复合酶法是4种方法中的最佳提取方法。所以试验采用超声波协同复合酶法进行进一步工艺优化。

图1 不同提取方法对圣女果皂苷提取率的影响

2.2 料液比对圣女果皂苷提取率的影响

由图2可知，料液比对圣女果皂苷提取率影响较大。随着料液比的增加，料液比为1∶40（g/mL）时提取率最高（0.308%），料液比超过1∶40（g/mL）时开始逐渐下降。其原因可能是料液比越小，即水溶剂用量越大，越有利于水溶性番茄皂苷的溶出，导致皂苷提取率增加；但料液比达一定值后，水溶剂用量的增加会造成提取液中复合酶浓度的降低，也会造成单位提取液中番茄皂苷浓度的降低，导致番茄皂苷提取率的下降[26]。因此，选择料液比1∶40（g/mL）为宜。这与郑威等[27]在人参总皂苷提取条件优化中的料液比趋势一致。

图2 料液比对圣女果皂苷提取率的影响

2.3 复合酶浓度对圣女果皂苷提取率的影响

由图3可知，随着复合酶浓度的增加，圣女果皂苷提取率呈逐渐上升后降低的趋势，酶浓度0.2%时得率最高。复合酶浓度继续增加，总皂苷提取率有所下降。其原因可能是复合酶对圣女果细胞壁起到酶解作用，使圣女果中的有效物质充分提取出来，将圣女果较大程度酶解；当底物浓度不能对酶达到饱和时[28]，酶解作用受到抑制，圣女果皂苷提取率发生下降趋势。陈思呈等[22]研究番茄的总皂苷提取时发现当酶用量到达最佳值时后逐渐下降，这与此次试验结果基本一致。因此选择复合酶浓度0.2%为宜。

2.4 酶解时间对圣女果皂苷提取率的影响

由图4可知，随着酶解时间的逐渐增大，圣女果皂苷提取率显著增高。当酶解时间为1.5 h时，提取率最高；当酶解时间大于1.5 h时，随着酶解时间的延长，皂苷提取率呈现下降趋势。其原因可能是酶解时间到达1.5 h时圣女果细胞的细胞壁基本被破坏，圣女果总皂苷已完全溶解出，再延长酶解时间，会使圣女果总皂苷结构发生变化，从而导致提取率呈现下降趋势[29]。这与李祥等[29]在研究茶皂苷酶法提取工艺的结果一致。因此选择酶解时间1.5 h为宜。

图3 酶浓度对圣女果皂苷提取率的影响

图4 酶解时间对圣女果皂苷提取率的影响

2.5 超声时间对圣女果皂苷提取率的影响

由图5可知，超声时间30 min提取率最高。超声时间在10～30 min范围内，圣女果皂苷提取率逐渐增大；超声时间在30 min后降低呈现稳定趋势。说明超声30 min已将圣女果皂苷最大溶解出，过长的超声时间会使生产成本变高，不适宜工业化生产。因此选取超声时间30 min为宜。

2.6 正交试验

在上述单因素试验的基础上，选取料液比、酶浓度、酶解时间、超声时间为试验因素，以圣女果皂苷提取率为考察指标，选取L9(34)进行正交试验，优化超声波协同复合酶法提取工艺条件。正交试验结果及分析见表2，方差分析见表3。

由表2可见，由R值可得出提取率影响因素大小依次为A＞B＞C＞D，试验最佳提取条件为A3B3C1D3。由表3方差分析可知，料液比、酶浓度、酶解时间对圣女果总皂苷提取率影响显著，超声时间影响不显著，这表明在各个因素所考察的范围内，料液比、酶浓度、酶解时间是一个重要因素，因此圣女果总皂苷最佳提取条件为A3B3C1D3，而超声时间对圣女果皂苷提取率影响不大，从节约时间和经济的方面考虑，最佳条件选择D2。因此，试验最佳提取条件定为A3B3C1D2，即料液比1∶60（g/mL）、酶浓度0.3%、提取时间1 h、超声时间20 min。

图5 超声时间对圣女果皂苷提取率的影响

表2 圣女果皂苷L9(34)正交试验结果

表3 正交试验方差分析

2.7 验证试验

按照正交试验结果筛选出最佳提取条件A3B3C1D2进行验证，重复5次。验证试验结果表示，提取率平均值与正交试验结果差距不大，提取率平均值为0.37%。验证结果见表4。

表4 验证性试验结果

3 结论

研究结果表明，通过比较水提法、酶提法、醇提法、超声波协同复合酶法4种不同提取方法对圣女果皂苷提取率的影响，得出超声波协同复合酶法为最佳提取方法。在单因素试验中，料液比、酶浓度、酶解时间、超声时间4个因素随着因素水平的增加，均呈先上升后下降的趋势。在正交试验中，各因素对圣女果皂苷提取率影响顺序为：料液比＞酶浓度＞酶解时间＞超声时间。圣女果提取皂苷的最佳工艺条件为：料液比1∶60（g/mL）、酶浓度0.3%、提取时间1 h、超声时间20 min。此条件下圣女果皂苷提取率为0.37%。此次试验优化的工艺可为圣女果皂苷工业化生产以及皂苷化合物的综合利用提供一种新的途径。