刃针疗法对膝骨关节炎白兔膝关节软骨组织黏着斑激酶/丝裂原活化蛋白激酶信号通路的调控作用▲

陈 嘉 盛关云 侯建华 杨雄武 黄吉辉 杨学义

(广西柳州市中医医院综合骨科，柳州市 545000，电子邮箱：dadadidi553@126.com)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)常表现为关节疼痛和关节功能障碍。现代医学认为KOA的病理症状是因关节软骨损伤所致[1]。良性的应力刺激可维护骨代谢平衡，而这是通过软骨表面的力学信号感受器来诱发力学信号通路实现的[2]。整合素β1所介导的黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)信号通路是软骨表面特殊力学的主要传导通路之一[3]。FAK作为一种胞质非受体蛋白酪氨酸激酶，活化后能与多种下游分子结合，同时还能启动丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路。在不同的刺激因素下MAPK可被激活而形成不同的转导通路，其中细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38MAPK这3条信号通路与骨关节炎关系密切。本实验以KOA兔模型作为研究对象，观察刃针干预对KOA兔膝关节软骨组织整合素β1、p38、FAK、JNK等蛋白表达的影响，并分析针刀干预的力学转导通路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 仪器：X光机(上海先威光电科技有限公司，型号：X-BJI)；HANS 穴位神经刺激仪(南京济生医疗科技有限公司,型号：LH202H)；微型涡旋混合仪(苏州江东精密仪器有限公司，型号：WH-3)；蛋白质电泳及转膜系统(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(美国Alpha Innotech公司)；全波长多功能酶标仪(Tecan 奥地利公司，型号：Tecan Infinite 200 PRO)；汉章牌一次性无菌刃针(北京华夏针刀医疗器械厂，规格：0.40 mm×40 mm)；华佗牌一次性无菌电针(苏州医疗用品厂有限公司，规格：0.25 mm×25 mm)。

1.1.2 试剂：抑制剂PF-562271(美国塞立克公司，批号:S2890)；整合素β1抗兔单克隆抗体(上海雅吉生物科技有限公司，批号：S-0342R)；FAK抗兔单克隆抗体(武汉纯度生物科技有限公司，批号：253012)；p38鼠抗兔单克隆抗体(北京百奥莱博科技有限公司，批号：ABM40362)；JNK鼠抗兔单克隆抗体(美国Santa Cruz公司，批号：BYK-2592R)；ERK1/2抗兔单克隆抗体(美国Santa Cruz公司，批号：GMS41076)；二抗山羊抗小鼠IgG(北京天德悦生物科技有限责任公司，批号:S001)；蛋白提取试剂盒(碧云天生物有限公司，批号：C3702)；二喹啉甲酸法蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物有限公司，批号：AR0146)。

1.2 实验动物 选取6月龄新西兰白兔63只(购自济南金丰实验动物有限公司)，均由柳州市中医医院综合实验室喂养，许可证号：ZKL(桂)20180605。白兔体重2.5～3.0 kg,雌雄不限，普通级，均为单笼规律喂养，自由摄食和饮水，自然光线照射，相对湿度40%～60%，室温(22±2)℃，定期紫外线消毒。

1.3 模型制备 在63只白兔中，采用随机数字法选取54只白兔的右下肢进行造模，采用前交叉韧带切断术建立兔KOA模型。造模前禁食，使用5%的水合氯醛(3 mL/kg)经耳缘静脉注射麻醉白兔，麻醉后仰卧固定于操作台上，常规备皮、消毒，沿膝关节内侧做长纵弧形切口，逐层剖解浅筋膜、肌肉，将髌韧带移向膝外侧，剖解关节囊，屈曲膝关节，找出前交叉韧带并剪断；彻底止血，将髌骨复位，采用3-0可吸收缝线闭合关节筋膜、关节腔，然后采用2-0丝线缝合皮肤。术后给予每只白兔肌肉注射青霉素20 U/次，预防感染，2次/d，连续注射3 d。术后每日笼外放养2 h，使术侧膝关节主动屈伸活动，常规标准饲养4周。造模前及造模后4周均行X线检查，了解白兔膝关节内外侧间隙、关节面、关节边缘以及软骨下骨情况，如X线检查提示骨质疏松，关节面不规则，关节间隙狭窄，软骨下骨质硬化以及边缘唇样改变，表示建模成功。

1.4 动物分组 造模的54只白兔中，2只出现感染，1只出现神经压迫损伤，3只出现骨折，最终共48只造模成功。采用随机数字表法将造模成功的48只白兔随机分为模型组、模型抑制组、刃针组、刃针抑制组、电针组、电针抑制组，每组8只。而9只未造模的白兔中，有1只出现足底溃烂，最终纳入8只白兔作为空白组。

1.5 干预方法

1.5.1 空白组：规律饲养，不予任何干预。

1.5.2 模型组：造模成功后规律饲养，不予任何治疗。

1.5.3 刃针组：造模成功后1 d，按照《灵枢》“经筋理论”阐述的经筋分型[4]，在患肢髌周、双膝眼、膝后处找到条索、筋结或厚实感状的阳性反应区，用龙胆紫定位进针部位，常规备皮、消毒。用刃针快速刺入皮肤切面，向结节的纵轴方向进行上下松解，以刺破深筋膜让其张力降低为宜。出针时按压片刻予以止血；刃针治疗后给予梁丘、阳陵泉、足三里推拿，以拔伸牵引法为主，按压松弛肌肉起止点，调整肢体力线。隔日治疗1次，1周3次，共治疗2周。

1.5.4 电针组：造模成功后1 d，根据比较解剖取穴法结合模拟骨度取穴法[5]，参照《实验针灸学》[6]取阴陵泉、阳陵泉、内外膝眼穴位，采用神经刺激仪进行电针刺激，频率2/100 Hz，强度3 mA，20 min/次。隔日治疗1次，1周3次，共治疗2周。

1.5.5 抑制组：刃针抑制组和电针抑制组均在每次治疗前的2 h内给予关节腔注射抑制剂PF-562271(200 μmol/L，0.5 mL)，其余操作与对应非抑制组(刃针组或电针组)相同。模型抑制组的抑制剂使用与上述同步进行。隔日治疗1次，1周3次，共治疗2周。

1.6 观察指标检测方法

1.6.1 标本收集：各组干预结束后，采用10%水合氯醛按照2 mL/kg进行耳缘静脉注射，麻醉后处死所有白兔，打开白兔的右下肢膝关节腔，剔除周围韧带、滑膜、半月板等组织，分别用咬骨钳在股骨髁以及胫骨平台负重软骨面迅速取出大约1cm×1cm的软骨-骨标本，用磷酸缓冲盐溶液冲洗组织块上的血液、黏液、污物等，置于液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱冻存待检。

1.6.2 光镜观察：取空白组和模型组的膝关节软骨标本，放入乙二胺四乙酸脱钙液依次进行脱水、透明、脱蜡，然后进行石蜡包埋，切片厚度6 μm；采用苏木精-伊红染色法，光镜下观察兔膝关节软骨情况。

1.6.3 蛋白免疫印迹分析：采用蛋白免疫印迹法检测各组的膝关节软骨组织整合素β1、FAK、ERK1/2、p38、JNK蛋白表达水平。取膝关节软骨组织，采用细胞裂解法提取总蛋白，采用二喹啉甲酸法蛋白浓度测定试剂盒检验蛋白浓度后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶恒压80 V，约20 min，分离胶恒压160 V。电泳结束后，于硝酸纤维素膜转移电泳槽以恒流200 mA转膜 2 h，聚偏二氟乙烯膜在5%的脱脂牛奶，37℃恒温中封闭2 h；洗膜后分别加整合素β1、FAK、p38、ERK1/2、JNK(1 ∶500稀释)，4℃孵育过夜；PBST漂洗滤膜4次，5 min/次；加辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶5 000稀释)，37℃孵育2 h，PBST 漂洗滤膜4次，5 min/次；按0.1 mL/cm2显影液计算用量，将显影液加在聚偏二氟乙烯膜上，室温放置1 min，用保鲜膜包好。暗室中迅速将聚偏二氟乙烯膜蛋白贴在X光胶片上曝光，洗片机中显影、洗像，然后采用Image J 软件定量分析各目标蛋白值，实验重复3次，取平均值。

1.7 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。其中计量资料若数据呈正态分布则采用(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析；若数据不符合方差齐性，则采用Tamhane′s T2方法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物行为及光镜下形态学的观察结果 造模后的白兔患肢均有所收缩，活动明显减少，且伴轻度全身反应症状(如周身颤抖、回头、乱窜、挣扎)，轻度跛行，但蹬地有力。光镜下观察发现，空白组白兔的膝关节骨层次(例如表浅层、移行层、辐射层、钙化层等)完整，而模型组白兔膝关节骨层次紊乱不清，且存在分层剥脱、细胞弥漫性增生、细胞簇集，见图1。

图1 空白组与模型组白兔膝关节的病理学表现(苏木精-伊红染色，×100倍)

2.2 7组兔膝关节软骨整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表达水平比较 与空白组对比，模型组整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。与模型组比较，刃针组、电针组的整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表达水平均降低(均P<0.05)。与电针组对比，刃针组整合素β1、JNK及ERK1/2蛋白表达水平降低(均P<0.05)，而两组FAK、p38表达水平比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。与对应干预方法组比较，使用抑制剂的各组整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表达水平下降(均P<0.05)。

表1 7组白兔膝关节软骨相关蛋白相对表达水平比较(x±s)

注：与空白组对比，*P<0.05；与模型组对比，#P<0.05；与刃针组对比，▲P<0.05；与电针组对比，●P<0.05。

3 讨 论

目前，临床上对早、中期KOA患者多采用保守治疗，晚期则趋向于人工关节置换术。“经筋理论”认为，KOA属“经筋痹”，以经筋所属筋肉、关节为主，治疗上应该以理筋活络、解结消散为原则[7]。但由于缺乏传统中医理论指导治疗KOA的分子生物学机制研究，以及现代医学认可的证据，导致其在医学界的推广应用受到阻碍。探讨中医理论指导治疗KOA的分子生物学机制具有重要意义。刃针疗法是在小针刀基础上发展而来的一种更安全的微创疗法，能较好地调节膝骨关节面的力学分布，恢复关节动静力平衡，降低肌肉、筋膜等软组织的异常张力，对软组织起到一种松懈作用。已有大量研究表明，“经筋理论”指导下使用针刀治疗KOA可取得很好的临床效果[8-11]。因此，本研究旨在探讨刃针干预促进KOA缓解的可能力学转导通路。

KOA最早的病变部位源于关节软骨。膝关节软骨“磨损”是KOA的经典病理改变，机械应力在膝关节软骨的病理性改变中起着重要作用[12]，而膝关节应力不足或过度也会引发关节软骨细胞凋亡和细胞外基质降解[13-14]。细胞信号通路在KOA的发生发展过程中起到至关重要的作用。细胞信号通路不断地将生理或病理的外界信号刺激(细胞因子、生长因子、力学信号等)传递至软骨细胞内，其异常表达会影响关节软骨细胞的生长分化，造成关节软骨退变。 整合素是关节软骨表面的机械应力的敏感受体[15]，本质为细胞黏附分子，分为α和β两种亚基型。其中，整合素β1在介导外界各种应力刺激向细胞内转化的过程中起着重要作用[16]。FAK是整合素β1介导的信号通路中主要成分，其可与多种下游分子结合，使其磷酸化，并启动整合素下游的MAPK信号通路，调节细胞功能。一旦MAPK信号转导途径被激活，其通路中的关键蛋白(p38、JNK、ERK)会被磷酸化[17]，因此JNK、p38、ERK表达水平被作为反映MAPK信号转导通路是否被激活的指标。其中，JNK参与多种细胞因子和应力刺激诱导的细胞凋亡过程[18]；而p38则属于MAPK家族中的应激活化蛋白激酶，p38MAPK信号通路被激活后，能促进炎症因子、基质金属蛋白酶、前列腺素、环氧化酶等物质的靶基因表达，进而导致软骨成分丢失和破坏，从而产生相应的炎症反应[19-20]；ERK可介导软骨细胞终末分化、细胞增殖，是一条具有显著特点的MAPK信号转导通路，也是控制软骨细胞增殖、分化的主要途径[21]。已有研究证实，ERK1/2能促进软骨细胞增殖和肥大细胞分化，从而使软骨钙化，骨赘形成[22]。可见，p38、JNK、ERK都可以诱导软骨细胞产生基质金属蛋白酶，加速关节软骨病理性降解，并参与软骨细胞增殖、分化、凋亡等一系列反应。因此FAK-MAPK这条介导的信号通路在调节软骨细胞功能、抑制胶原和蛋白多糖合成以及其关键蛋白的表达将直接影响关节软骨的完整性。

本研究中，模型组的白兔患肢活动明显减少，且伴轻度全身反应症状及轻度跛行，光镜下可见膝关节出现典型的病理改变，进一步证实KOA模型成功建立。本研究模型组白兔的膝关节软骨组织中整合素β1、FAK、p38、JNK、ERK1/2蛋白表达水平均高于空白组(P<0.05)，提示FAK-MAPK信号通路在KOA发生发展过程中起着重要的调控作用：KOA所致关节制动造成膝关节力学平衡失调，力学信号发生转变，并传导至细胞膜后调控相关的基因表达，使其构型发生改变，造成软骨成分丢失。有研究表明，针刺穴位能有效地剥离病灶部位的粘连，舒展挛缩，使动态平衡失调得到纠正，促进患膝关节软骨修复[22]。本研究中，在对白兔患膝关节进行刃针或电针干预后也发现，刃针组和电针组白兔的膝关节软骨组织中整合素β1、FAK、p38、JNK、ERK1/2蛋白表达水平均低于模型组(P<0.05)，提示刃针和电针通过调节FAK-MAPK信号通路，改变患膝关节力学应力异常状态，这或是其促进KOA关节软骨修复的可能机制。同时，本研究结果还显示，给予整合素β1、FAK、p38、JNK、ERK1/2的特异性抑制剂(PF-562271)预处理后，模型抑制组、刃针抑制组、电针抑制组的整合素β1、FAK、p38、JNK、 ERK蛋白表达水平分别低于模型组、刃针组、电针组(均P<0.05)。这提示特异性抑制剂PF-562271能够抑制KOA白兔膝关节软骨中整合素β1、FAK、p38、JNK、ERK1/2的表达，同时也说明了FAK-MAPK力学信号通路或能介导刃针和电针干预的膝关节软骨修复过程。此外，刃针组的整合素β1、JNK、 ERK1/2蛋白表达水平均低于电针组(均P<0.05)，说明刃针对FAK-MAPK这一力学转导信号通路的干预作用可能更大。

综上所述，FAK-MAPK信号通路在KOA发生和发展过程中起着重要的调控作用，而刃针治疗可有效地降低KOA白兔FAK-MAPK信号通路中的整合素β1、JNK、ERK1/2蛋白的过度表达，且其干预作用优于电针疗法，这或是其促进膝关节软骨修复的力学机制。由于本实验只是针对单一动物(白兔)和单一的FAK- MAPK信号通路进行观察，是否还存在其他信号通路，或其与这些信号通路是否有交叉作用，目前尚未清楚，仍需更加全面而完整的实验研究来进一步证实。